Doktorarbeit Nina Ewerdwalbesloh - Universität zu Lübeck

Material und Methoden
2.5 Transfektionsversuche
2.5.1 Oligonukleotide
Für unsere Versuche wurden thiolierte Oligonukleotide verwendet, die von der Firma
Eurogentec (Seraing, Belgien) und von Metabion (Martinsried) durch High-Performance
Liquid Chromatography (HPLC) aufgereinigt wurden. Die Antisense-ON waren gegen
das Start-Codon des Ki-67-Proteins gerichtet, damit wurden beide Isoformen des Proteins
erreicht. Diese Sequenz hatte sich im Vergleich von 13 neu entworfenen AS-ON als eine
der beiden effektivsten erwiesen (Kausch et al., 2003) Zur Kontrolle wurde
Nonsense(NS)-Oligonukleotide verwendet. Die gelieferten Oligonukleotide wurden mit
Merck-Wasser gelöst, wobei die hergestellte Konzentration 500 nM betrug. Danach
wurden die ON bei –20°C gelagert. Homologien zu anderen Genen wurden durch Blast
search software, welche Sequenzen mit mehr als sieben korrespondierenden Basen sucht,
evaluiert.
Oligonukleotid
AS
NS
NS-FITC
Sequenz
5'-ACC AGG CGT CTC GTG GGC CAC AT-3'
5'-AGT ACT CAG TAA CGC CTA CGG TAA G-3'
FITC-5'-AGT ACT CAG TAA CGC CTA CGG TAA G-3'
2.5.2 siRNA
Die siRNA wurde von IBA (Göttingen) synthetisiert. Zur Kontrollmessung wurden beide
Einzelstränge (Sense und Antisense) der doppelsträngigen siRNA verwendet. Die
gelieferte siRNA wurde in DEPC-Wasser gelöst. Es wurde die Konzentration 100 µM
erstellt. Gelagert wurde die RNA bei –20°C.
RNA
AS
S
siRNA
Cy3-siRNA
Sequenz
5'-GGC GUC UCG UGG GCC ACA UTT-3'
5'-AUG UGG CCC ACG AGA CGC CTT-5'
AS- und S-Strang aneinandergelagert
5'-markierte siRNA
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