Bedeutung des Lymphotoxin-β-Rezeptors für die Bildung von ...

MATERIAL UND METHODEN
B-Lymphozyten (anti-CD45R/B220) oder gegen Follikulär Dendritische Zellen (anti-FDC-
M1) für eine Stunde inkubiert. Darauf folgte für 30 Minuten die Inkubation mit dem
Brückenantikörper (anti-Ratte-Ig) in 5 %igem normalem Mausserum. Nach 30 Minuten
Inkubation mit dem Ratte-APAAP-Komplex erfolgte der Nachweis über Fast Blue BB in
APAAP-Substrat, das für 25 Minuten auf den Schnitt gegeben wurde. Die markierte
Avidin-Biotin-Methode wurde zum Nachweis von T-Lymphozyten (anti-TCR-β),
metallophilen Makrophagen (anti-MOMA-1) und Keimzentren angewendet. Letztere
wurden mit Hilfe des aus der Erdnuss Arachis hypogaea gewonnenen Lectins (Peanut
agglutinin, PNA), das an B-Zellen im Keimzentrum bindet, dargestellt. Nach einstündiger
Inkubation mit dem biotinylierten Antikörper bzw. PNA wurde für 30 Minuten der Avidin-
Peroxidase-Komplex auf den Schnitt gegeben. Als Nachweisreagenz diente
Diaminobenzidin, das für 5 Minuten auf den Schnitt gegeben wurde. Schließlich wurden
die Objektträger für die Mikroskopie mit wässrigem Eindeckmittel eingedeckt.
2.4. Quantitative Bestimmung der mRNA-Expression
Alle Verdünnungen von Proben und Lösungen wurden mit DEPC-H 2 O durchgeführt. Von
den bei der Organentnahme eingefrorenen und bei -80°C gelagerten Milzen und
Milztransplantaten wurden 10 µm dicke Kryostatschnitte angefertigt und diese entweder
im Ganzen in ein Reaktionsgefäß mit 300 µl RLT-Puffer (RNeasy® Mini Kit) gegeben
oder einzeln auf Folienobjektträger aufgebracht und mit Toluidinblau gefärbt. Dazu
wurden die Schnitte 30 Sekunden in Ethanol (75%) fixiert und anschließend in DEPC-H 2 O
30 Sekunden gespült. Nachfolgend wurde für 10 Sekunden in Toluidinblau-Lösung gefärbt
und zweimal für 15 Sekunden in DEPC-H 2 O gespült. Abschließend wurden die Schnitte in
zwei Schritten jeweils 30 Sekunden in Ethanol (100%) entwässert. Jeder zehnte Schnitt
wurde auf einem Glasobjektträger fixiert und zur Identifizierung der Kompartimente, wie
oben beschrieben, immunhistologisch gefärbt.
Laser Mikrodissektion
Durch den Vergleich der immunhistologisch gefärbten Kontrollschnitte mit den mit
Toluidinblau gefärbten Schnitten konnten die Kompartimente PALS, Follikel und Rote
Pulpa eindeutig identifiziert werden. Diese wurden mit Hilfe der PALM® RoboSoftware
markiert, dem gepulsten, ultravioletten Laser der Mikrodissektionsanlage ausgeschnitten,
in Verschlusskappen von Reaktionsgefäßen gesammelt und sofort in 300 µl RLT-Puffer
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