Bedeutung des Lymphotoxin-β-Rezeptors für die Bildung von ...
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MATERIAL UND METHODEN<br />
(RNeasy® Mini Kit) verbracht. Von jedem Kompartiment wurden so 3,5 x 10 6 µm 2 <strong>für</strong> <strong>die</strong><br />
mRNA-Analyse isoliert.<br />
RNA-Isolation und cDNA-Synthese<br />
Aus den Proben wurde <strong>die</strong> vollständige RNA mit dem RNeasy® Mini Kit nach Angaben<br />
<strong>des</strong> Herstellers isoliert. Dazu wurden <strong>die</strong> in RLT-Puffer (RNeasy® Mini Kit) befindlichen<br />
Proben <strong>für</strong> 10 Sekunden bei 12000 U/Min zentrifugiert und anschließend durch<br />
mehrmaliges Aufziehen mit einer Einwegspritze <strong>die</strong> genomische DNA geschert. Nach<br />
Zugabe <strong>von</strong> Ethanol (70%) im Verhältnis 1:1 (v/v) wurde <strong>die</strong> Probe über Säulen (RNeasy®<br />
Mini Kit) 15 Sekunden bei 10000 U/Min zentrifugiert und das Filtrat verworfen.<br />
Aufeinander folgend wurde mit 700 µl RW1-Puffer (RNeasy® Mini Kit) sowie 500 µl<br />
RPE-Puffer (RNeasy® Mini Kit) jeweils 15 Sekunden und mit 500 µl RPE-Puffer 2<br />
Minuten bei 10000 U/Min gewaschen und das Filtrat verworfen. Abschließend wurde <strong>die</strong><br />
Säule <strong>für</strong> 1 Minute bei 14000 U/Min getrocknet. Die Eluierung der RNA aus der Säule<br />
erfolgte mit 30 µl DEPC-H 2 O <strong>für</strong> 1 Minute bei 10000 U/Min, wobei das erste Eluat ein<br />
zweites Mal über <strong>die</strong> Säule gegeben wurde. Die Säule wurde nun verworfen und das Eluat<br />
<strong>für</strong> 13 Minuten bei 60°C in der Vakuumzentrifuge auf 12 µl reduziert, um <strong>die</strong><br />
Konzentration an RNA zu erhöhen. Die so vorbereiteten Proben wurden mit je 1,5 µl 10x<br />
DNase-Puffer und DNase-I-Enzym (bei<strong>des</strong> Deoxyribonuklease I-Kit) versetzt und 15<br />
Minuten bei 20°C inkubiert, um <strong>die</strong> verbliebene genomische DNA zu verdauen. Nach<br />
Zugabe <strong>von</strong> 1,5 µl Stopp-Lösung (Deoxyribonuklease I-Kit) wurde <strong>für</strong> 10 Minuten auf<br />
70°C erhitzt, sofort auf Eis gekühlt und 2 µl DEPC-H 2 O zugegeben. Von der Probe<br />
wurden <strong>für</strong> den Positiv-Ansatz 11,5 µl mit 8 µl Mastermix <strong>für</strong> reverse Transkription und<br />
0,5 µl (100 U) Reverse Transkriptase versetzt. Für <strong>die</strong> Negativ-Kontrolle wurden 5,5 µl der<br />
Probe mit 4 µl Mastermix <strong>für</strong> reverse Transkription und 0,5 µl DEPC-H 2 O gemischt. Beide<br />
Ansätze wurden aufeinander folgend <strong>für</strong> 10 Minuten bei 25°C (Bindung <strong>des</strong> Random-<br />
Primers), 50 Minuten bei 42 °C (Reverse Transkription der mRNA in cDNA) und 15<br />
Minuten bei 70°C (Reaktionsstopp) inkubiert. Für <strong>die</strong> Lagerung bis zur Durchführung der<br />
Polymerase Kettenreaktion (PCR) wurden <strong>die</strong> cDNA-Proben bei -20°C eingefroren.<br />
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