Determination of Bovine Kappa-Casein Genotype by PCR ... - Boku

Molekularbiologische Übungen I Beispiel Genotyp Version: 02.10.2008 

Protokoll Beispiel Genotyp 

Nachweis der Rinder Kappa-Casein Genotypen mittels PCR 

Amplifizierung und Restriktionsverdau, Southern-Blot und 

Sequenzanalyse 

(Betreuer Teil 1-3: Dr. Richard Strasser, Betreuerin Teil 4-8: Dr. Marie-Theres Hauser) 

Zeitplan 

1. Teil (3-4h) Montag: Zellextraktion und PCR 

(unbedingt eine leere Diskette mitnehmen – pro Diskette können 2 

Fotos gespeichert werden!) 

2. Teil (3-4h) Dienstag: Agarose-Gelelektrophorese 

Reinigung der PCR Produkte 

Restriktions-Endonuclease-Verdau 

3. . Teil (1-2h) 

4. Teil (1-2h) 

Mittwoch: Agarose-Gelelektrophorese des Restriktionsverdaus 

16 – 17:30 Uhr Aufbau des Southern-Blots 

4. . Teil (0.5h) 

über Nacht 

Donnerstag 13 – 13:30 Uhr 

Blotten 

Blot-Abbau, UV-Crosslinken 

5. Teil (1-2h) 

13:30 – 14 Uhr Vorhybridisierung 

über Nacht 

Hybridisierung 

6. Teil (2-3h) 

ab ca. 14:30 Uhr Sequenzanalyse, 

Pufferherstellung für Freitag 

7. Teil (3-4 h) Freitag 9 – 10 Uhr Waschen 

10 – 12 Uhr Immundetektion 

12 – 13 Uhr Exposition auf den Röntgenfilm 

und Entwicklung 

ab 13:30 Uhr 

Abschlußbesprechung bei Dr. Hauser oder 

Dr. Strasser (beide im 4 .Stock) 

Empfohlene Literatur: 

1. Prüfungsunterlagen Beispiel Genotyp 

2. Kappa Casein Genotypisierung: Medrano et al., 1990, Biotechnology, 8: 144-146 in der FB-BIO 

Z1231 oder beim Tutor erhältlich 

3. Der Experimentator: Molekularbiologie / Genomics; C. Mülhardt, 4. Aufl. 2003; ISBN 3-8274-1460- 

1; FB-BIO I-96123 

4. "The DIG System User's Guide for Filter Hybridization" 

http://www.roche-applied-science.com/fst/publications.htm?/PROD_INF/MANUALS/DIG_MAN/dig_toc.htm 

5. Molecular Biology – A Project Approach by Susan J. Karcher, FB-BIO I 69715 

6. Nucleic Acid Analysis – Principles and Bioapplications by Charles A. Dangler, FB-BIO I 71547 

7. Nonisotopic DNA Probe Techniques by Larry L. Kricka, FB-BIO I 603012 

1


8. Probes 1 and 2 – A practical approach by B.D. Hames and S.J. Higgins, FB-BIO I 69649/1 bzw. /2 

9. http://biology.neehow.org/wonderful/protocols/ind-prtc97.html#toc 

10. http://www.nwfsc.noaa.gov/protocols.html 

11. http://www.protocol-online.net/ 

12. Datenbanken/NCBI: 

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query/static/help/helpdoc.html#Introduction 

13. Literatursuche: Pubmed - 

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?rid=helppubmed.section.pubmedhelp.Searching_PubM 

ed#pubmedhelp.A_basic_search 

14. Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) 

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?rid=handbook.chapter.610 AND 

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=pubmed&list_uids=15215342&dopt=Citation 

2


Einführung 

Unter Caseinen versteht man eine Familie von Milchproteinen (alpha, beta, und kappa- 

Caseine), die in mehreren Allel-Varianten vorkommen. Kappa-Caseine (κ-CN) zum Beispiel 

existieren in verschiedenen allelischen Formen (z.B. Allele A, B, C, E), die einen besonderen 

Einfluß bei der Milch- und Käseproduktion haben. Daher werden bestimmte Genotypen für 

die Zucht bevorzugt. 

Im vorliegenden Beispiel wird eine Methode beschrieben, die eine rasche und zuverlässige 

Genotypisierung der Rinder κ-CN Allele erlaubt. Im Gegensatz zur direkten Analyse von 

Milchproteinen erlaubt diese Methode eine Genotypisierung direkt aus Spermazellen, Blut 

oder Gewebe. Ein 494 Basenpaare (bp) langes DNA-Fragment des Rinder κ-CN-Gens wird 

aus Stier-Spermazellen mittels Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) amplifiziert und einem 

Restriktionsverdau unterzogen. Die Identität des PCR-Produktes bzw. DNA-Fragmentes 

kann mit Hilfe einer Sequenz-Analyse und anschließendem Datenbankvergleich sowie mit 

einem Southern-Blot bestätigt werden. 

Im vorliegenden Beispiel soll A) mittels Restriktionsverdaus eine Identifizierung des κ-CN AA, 

AB oder BB Genotyps durchgeführt werden, 

B) die Identität der Restriktionsfragmente mittels Southern Blot 

bestimmt werden und 

C) der Unterschied zwischen AA, AB oder BB Genotypen auf 

einem Sequenzanalyse-Chromatogramm festgestellt sowie 

D) eine Datenbanksuche durchgeführt werden. 

Aufgund einer Punktmutation in der DNA-Sequenz an Position 274 des PCR Produktes in 

Allel A entsteht eine zusätzliche Hinf I Schnittstelle, die in Allel B nicht vorkommt. Diese 

Schnittstelle kann daher verwendet werden um zwischen den κ-CN Genotypen A und B zu 

unterscheiden. Nach erfolgtem Hinf I Verdau erhält man je nach Genotyp unterschiedlich 

lange Fragmente bzw. eine unterschiedliche Anzahl von Fragmenten. 

JK500 

JK302 

* 

277 bp 85 bp 

132 bp 

Hinf I (A) Hinf I (A, B) 

Schematische Darstellung des PCR Produktes (494 bp) von Allel A und B (* = 

Punktmutation) amplifiziert mit Primer JK500 und JK302. Der grüne Balken markiert die 

Sonde, die bei der Southern Blot Analyse verwendet wird. 

3


DURCHFÜHRUNG 

1. TEIL 

1.1. Reinigung von genomischer DNA aus Rindersperma 

Da für die PCR nur wenig Ziel-DNA eingesetzt werden muß, erfolgt nur eine rohe Extraktion 

der genomischen DNA aus Stiersperma. Die intakten Zellen werden mittels Percoll- 

Dichtezentrifugation isoliert und mittels Detergens (SDS), einer reduzierenden Substanz 

(DTE) sowie Proteinase K aufgeschlossen. Die DNA liegt nach dieser Behandlung im 

Überstand vor und kann ohne weitere Reinigungsschritte für die anschließende PCR 

verwendet werden. 

Gerät: 

Material: 

Lösungen: 

Tischzentrifuge 

Heizblock 

1 Röhrchen mit Stier-Spermazellen (ca.10 6 –10 7 Zellen, beim Tutor erhältlich!) 

(Nach dem Erhalt der Probe soll sofort mit Schritt 1 begonnen werden!) 

Reaktionsgefäße: 1.5 ml und 0.3 ml 

Schere, Skalpell 

Kolbenhub-Pipetten (1000 µl, 200 µl, 20 µl) 

Blaue und gelbe Pipettenspitzen 

dH 2 O (sterile deionized water) 

10 x PBS: für 1 l: 80 g NaCl, 2 g KCl, 14.4 g Na 2 HPO 4 , 2.4 g K 2 HPO 4 

2 x PBS durch Verdünnen mit dH 2 O aus 10 x PBS herstellen (ergibt ~ pH 7.3) 

1 x PBS durch Verdünnen mit dH 2 O aus 10 x PBS herstellen, pH mit HCl auf 

7.4 einstellen 

25% Percoll in 1 x PBS 

10 x PCR-Puffer: 100 mM Tris, pH 8.8, 500 mM KCl, 15 mM MgCl 2 , 1% Triton 

0.5 M DTE (Dithioerythritol, Antioxidants) in DMSO (dimethyl sulfoxide) 

42.5 µM SDS (Sodium Dodecyl Sulfate, anionisches Detergens) in dH 2 O 

Proteinase K (5 mg/ml) in dH 2 O 

1. Röhrchen mit Stier-Spermazellen an einem Ende (auf der Seite mit dem 

Glaswollstopfen) aufschneiden und über ein 1.5 ml Reaktionsgefäß halten. Danach 

vorsichtig das zweite Ende aufschneiden und die zähe Flüssigkeit in das 

Reaktionsgefäß tropfen lassen. (Es sollten ca. 100-200 µl Suspension im 

Reaktionsgefäß sein.) Zellsuspension mit 0.5 ml 2 x PBS gut durchmischen (mittels 

1000 µl Kolbenhub-Pipette resuspendieren, nicht vortexen!) und 2 min bei 8.000 rpm 

abzentrifugieren. (Tischzentrifuge verwenden). Den Überstand vorsichtig abheben 

(zuerst mit 1000 µl dann mit 200 µl Kolbenhub-Pipette) und verwerfen. 

4


2. Zellpellet 3 mal mit je 1 ml 2 x PBS waschen, d.h. Pellet gut resuspendieren (mittels 

1000 µl Kolbenhub-Pipette resuspendieren, nicht vortexen!) und wie in Punkt (1) bei 

8.000 rpm abzentrifugieren, Überstand vorsichtig abheben und verwerfen. 

3. Gewaschenes Pellet in 0.5 ml 1 x PBS gut resuspendieren (mittels 1000 µl 

Kolbenhub-Pipette resuspendieren, nicht vortexen!) und vorsichtig mit 0.5 ml 25% 

Percoll überschichten. 6 min bei 8.000 rpm zentrifugieren, Überstand vorsichtig 

abheben und verwerfen. 

4. Pellet noch einmal wie in Punkt 3. mit 1 x PBS (ohne Percoll!) waschen, bei 8.000 

rpm 2 min zentrifugieren und Überstand gut absaugen (sehr vorsichtig, keine Zellen 

abheben!). 

5. Folgende Lösung in einem 1.5 ml Reaktionsgefäß herstellen: 

39,0 µl dH 2 O 

5,0 µl 10 x PCR-Puffer 1 x PCR-Puffer 

2,0 µl DTE (0.5 M) (20 mM Endkonz.) 

2,0 µl SDS (42.5 µM) (1.7 µM Endkoz.) 

2,0 µl Proteinase K (5 mg/ml) (200 µg/ml Endkonz.) 

50,0 µl Endvolumen 

Pellet in 50 µl der Lösung mittels 200 µl Kolbenhub-Pipette resuspendieren 

1 h bei 37 o C inkubieren (Heizblock mit Schütteln), Suspension soll ziemlich klar werden. 

6. Proteinase K durch 10 min bei 95 o C inaktivieren (Heizblock); ausgefallenes Protein 

abzentrifugieren (5 min, 13.000 rpm). Überstand in frische Eppendorfhütchen 

überführen (DNA ist im Überstand enthalten), Pellet verwerfen. 

7. DNA Verdünnungen für PCR - Ansatz wie unten angeführt in 0.3 ml Reaktionsgefäße 

herstellen: Die einzelnen Verdünnungen jeweils gut mischen! Aus Ansatz 3 werden 

nach dem Verdünnen/Mischen noch 2.8 µl entnommen und verworfen (um das 

Volumen wieder auf 25 µl zu bringen). Alle Ansätze sollen auf Eis gelagert werden. 

2.8 µl 

2.8 µl 

2 µl DNA 

Pos.-Kontrolle 

1 

2 

3 

4 

5 

27.8 µl DNA 

25 µl dH 2 O 

25µl dH 

25. µl dH 2 O 2 O 

23µl dH 2 O 

Unverd. ~1:10 ~1:100 dH 2 O (Neg.-Kontrolle) Pos.-Kontrolle 

5


1.2. Durchführung der PCR 

Da es sich bei der PCR um eine sehr starke Anreicherung bestimmter DNA Stücke handelt 

(von einem Molekül können bis zu 10 8 Moleküle amplifiziert werden), kommt es häufig zu 

Kontaminationen. Daher ist es bei diesem Schritt besonders wichtig, sauber und genau zu 

arbeiten. 

Gerät: 

Material: 

Lösungen: 

Thermocycler (für 0.3 ml Reaktionsgefäße) 

Reaktionsgefäße (0.3 ml) 

Kolbenhub-Pipetten (200 µl, 20 µl) 

gelbe Pipettenspitzen 

dH 2 O (sterile deionized water) 

10 x PCR-Puffer: 100 mM Tris, pH 8.8, 500 mM KCl, 15 mM MgCl 2 , 1% Triton 

10 mM dNTP Mix (10 mM of each dATP, dCTP, dGTP, dTTP) 

Primer JK500 (20 µM bzw. 20 pmol/µl); JK302 (20 µM) 

Taq DNA-Polymerase (~5 U/µl) 

Positiv-Kontrolle: gereinigtes kappa-Casein 494 bp DNA-Fragment 

(~0.25pg/µl) 

Pro Person werden 5 Ansätze á 25 µl DNA (entsprechende Verdünnung) + 25 µl PCR- 

Prämix gemacht. 

PCR-Prämix (Reihenfolge einhalten): 

103,0 µl dH 2 O 

30,0 µl 10 x PCR Puffer 

3,0 µl dNTP Mix (je 10mM) 

6,0 µl Primer JK 500 (20 pmol/µl) 

6,0 µl Primer JK 302 (20 pmol/µl) 

vortexen 

2,0 µl Taq Polymerase (~5 U/µl) 

150,0 µl Gesamt (gut mischen, nicht vortexen) 

PCR- Ansätze: 

• Zu den Eppendorfhütchen 1-5, in denen sich bereits 25 µl DNA Verdünnungen (bzw. nur 

dH 2 O im Ansatz 4) befinden, werden 25 µl PCR-Prämix gegeben. PCR-Prämix zuerst zu 

1-4 dazugeben und zum Schluß zu 5, um eine Kontamination mit der Positiv-Kontrolle zu 

vermeiden. 

6


• Vorsichtig durchmischen, kurz abzentrifugieren 

Auf Thermocycler I stellen, Programm CHRMO wählen (Laufzeit: ca. 2,5h) 

(Programm mit Heizdeckel) 

Bei Programm CHRMO werden folgende Zyklen gefahren: 

1. initial Denaturation 2 min 95 o C 

2. Denaturation 45 sec 94 o C 

3. Annealing 1 min 50 o C 

4. Polymerisation 45 sec 72 o C 

Schritte 2-4 werden 30 x wiederholt (= 30 Zyklen) 

5. final Polymerisation 8 min 72 o C 

6. HOLD at 4°C HOLD 4°C 

2. TEIL 

2.1. Überprüfung der PCR mittels Agarose-Gelelektrophorese 

Zum Nachweis der Amplifizierung wird der Reaktionsansatz auf einem sogenannten 

Agarose-Minigel, in dem sich der fluoreszierende, DNA interkalierende Farbstoff 

Ethidiumbromid befindet, analysiert. Da das erwartete PCR Produkt nur 494 Basenpaare 

(bp) lang ist, soll ein 1,5%iges Agarosegel verwendet werden. 

Gerät: 

Material: 

Lösungen: 

Mikrowelle 

Spannungsquelle 

Minigel-Elektrophorese-Apparatur 

Transilluminator und Kamera 

Agarose 

Erlenmeyerkolben (250 ml) 

Frischhaltefolie 

Klebeband 

Kamm und Gelkassette 

USB-Stick mitnehmen 



Gelbe Pipettenspitzen 

50 x TAE (100 ml: 24.2 g Tris, 5.71 ml 100 %ige Essigsäure, 10 ml 0.5 M 

EDTA) 

1 x TAE: 50 x TAE mit H 2 O verdünnen 

7


Ethidiumbromid-Lösung (10 mg/ml) in dH 2 O (Achtung GIFTIG!) 

DNA-Längenstandard (50 ng/µl): 100 bp Leiter (GeneRuler 100 bp DNA 

Ladder Plus – Fa. MBI Fermentas, www.fermentas.com ): starke Bande = 500 

Basenpaare (bp) 

Ladepuffer: 6 x Orange Loading Dye (10 mM Tris-HCl, pH 7.6; 0.15% orange 

G, 0.03% xylene cyanol FF, 60% glycerol, 60 mM EDTA; Fa. MBI Fermentas) 

Gießen des Agarosegeles (ein Gel für 6 Studenten – teilweise stehen die Agarosegele 

bereits zur Verfügung ) 

• Die Gelkassette wird an den Enden mit einem Klebeband abgedichtet, damit das 

aufgeschmolzene Agarosegel nicht ausfließen kann (vorher Gelkassette an den Rändern 

mit EtOH entfetten). 

• 1.5 g Agarose werden in einen 250 ml Kolben eingewogen 

• 100 ml 1 x TAE Puffer dazugeben 

• Der Kolben wird mit einer Frischhaltefolie, (kein Alu!) in die einige Löcher gestochen 

werden, verschlossen 

• Agarose wird in der Mikrowelle aufgeschmolzen bis keine Schlieren mehr sichtbar sind 

(Kolben mehrmals aus dem Ofen nehmen und leicht schütteln) 

• Nach dem Abkühlen der Lösung auf ca. 60-55 o C 7 µl Ethidiumbromid Lösung dazu 

geben und gut durchmischen 

Vorsicht Ethidiumbromid ist GIFTIG (starkes MUTAGEN)! Es muss unbedingt mit 

Handschuhen gearbeitet werden! 

• Anschließend die Lösung vorsichtig in entsprechende Gelkassette gießen (luftblasenfrei), 

der Kamm zur Formung der Geltaschen wird vorsichtig eingesetzt (20-Taschen-Kamm) 

• Gel bei Raumtemperatur erstarren lassen (Minimum 30 min) 

• Gele können auch mit Kollegen geteilt werden. Es ist vorteilhaft gleich das Gel das in 

Punkt 3.1. gebraucht wird mitzugießen, pro Student werden 10 Taschen benötigt. Gele 

halten im Kühlschrank in Frischhaltefolie einwickelt mehrere Tage. 

Auftragen der Proben und Elektrophorese: 

• Erstarrtes Agarosegel in die Elektrophorese-Apparatur so einlegen, dass die DNA in 

Richtung Anode (von Schwarz nach Rot) wandern kann. Mit 1 x TAE überschichten 

(Taschen müssen mit Flüssigkeit bedeckt sein) 

8


• Aus der Verdünnungsreihe (Reaktionsgefäße 1-5) werden 20 µl Lösung in neue 1.5 ml 

Reaktionsgefäße gegeben. Aus Reaktionsgefäß 2: 2 x 20 µl nehmen! 

• 3 µl Ladepuffer dazugeben und in die Ladetaschen des Agarosegels überführen. Der 

Längenstandard enthält bereits Ladepuffer. 

• Die Proben werden folgendermaßen aufgetragen ( 6 Studenten verwenden ein Gel): 

Student 1 Student 2 Student 3 

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 

Unverdünnt 

Verdünnung ~ 1:10 ! 



Negativ-Kontrolle 

Positiv-Kontrolle 

Längenstandard (500ng) 

Unverdünnt 







Unverdünnt 




Negativ Kontrolle 


Student 4 Student 5 Student 6 

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 

Unverdünnt 







Unverdünnt 







Unverdünnt 




Negativ Kontrolle 


Längenstandard in Basenpaaren 

(bp): 

3000 bp 

2000 bp 

1200 bp 

600 bp 

500 bp 

400 bp 

300 bp 

200 bp 

100 bp 

• Die Elektrophorese bei 80 Volt bis ca. 45 min (60 Vhs) laufen lassen 

9


• Gele unter UV-Licht am Transilluminator betrachten. Bild mittels Kamera aufnehmen, 

ausdrucken und auf eine Diskette speichern. 

Jene beiden Proben, die das meiste PCR Produkt (494 bp) aufweisen, werden gereinigt 

(siehe 2.2.) und für den Restriktionsverdau und den darauffolgenden Southern-Blot 

verwendet. 

2.2. Reinigung der PCR-Fragmente mittels Gel Extraction Kit 

Für Restriktionsenzymanalysen, Sequenzierreaktionen und auch für den nachfolgenden 

Southern-Blot ist es günstig, wenn man reine PCR Fragmente - vor allem ohne der nicht 

verbrauchten Primer - verwendet (beim Southern-Blot könnte es zu unspezifischen 

Hybridisierungsreaktionen kommen). Daher ist es notwendig die amplifizierten PCR Stücke 

aus dem Agarosegel zu reinigen. 

Gerät: 

Material: 

Lösungen: 

UV-Transilluminator 

Waage 

Thermoblock 

Tischzentrifuge 

Mini-shaker (zum „Vortexen“) 

Skalpell 


Kolbenhub-Pipetten (1000 µl, 200 µl, 20 µl) 

Blaue und Gelbe Pipettenspitzen 

NucleoSpin Extract Kit (Firma Macherey-Nagel) 

• Jene 2 Proben, die das meiste PCR-Produkt auf einer Höhe von 494 bp aufweisen, 

werden für die Reinigung verwendet. Die DNA-Banden werden unter UV-Licht möglichst 

rasch mit einem Skalpell aus dem Gel geschnitten (nur wenig Gel, welches keine DNA 

enthält, mitschneiden, Vorsicht: nicht den Transilluminator beschädigen!) Gewicht des 

Reaktionsgefäßes nicht mitrechnen! Falls nur die Positiv-Kontrolle sichtbar ist, wird diese 

ausgeschnitten und gereinigt. Falls keine eigenen Banden vorhanden sind, wird entweder 

eine Bande (z.B. Positiv-Kontrolle) eines Kollegen ausgeschnitten und damit 

weitergearbeitet oder falls dies nicht möglich ist, wird eine Ersatzprobe (= eingefrorenes 

Gelstück) vom Tutor ausgegeben. 

Bei längerer Exposition am UV-Transilluminator werden DNA-Fragmente zerstört (UVcrosslinking, 

Mutagenese) und deren Sichtbarkeit verringert. 

10


Vor dem Ausschneiden das Gewicht eines leeren 1.5 ml Reaktionsgefäß mittels Waage 

bestimmen und notieren. 

Vorgang der Reinigung wie folgt (siehe auch E. coli Protokoll): 

• Die DNA-Bande wird mit einer sauberen Klinge aus dem Gel geschnitten (so wenig 

überschüssiges Gel wie möglich mitschleppen, das Gel sollte nicht mehr als 250 mg 

haben) und in ein 1.5 ml Reaktionsgefäß überführt. 

• 300 µl Puffer NT1 je 100 mg Gelstück 

zugeben (z.B. für 150 mg Gelstück 450 µl 

Puffer NT1). 

• 10 min bei 50 o C inkubieren (Gel wird 

aufgelöst). Alle 2 min kurz vortexen bzw. 

auf einem Schüttelheizblock inkubieren. 

• NucleoSpin Extract Spin Column in ein 2 ml 

„Collection“ – Reaktionsgefäß geben. 

• Die gesamte Probe in die NucleoSpin 

Extract Spin Column überführen und 1 min 

bei 12.000 rpm zentrifugieren. 

• Durchlauf entfernen und die Column wieder 

in das 2 ml „Collection“ – Reaktionsgefäß 

geben. 600 µl Puffer NT2 zugeben und 1 

min bei 12.000 rpm zentrifugieren. 

• Durchlauf entfernen und die Column wieder 

in das 2 ml „Collection“ – Reaktionsgefäß 

geben. 200 µl Puffer NT3 zugeben und 2 

min bei 12.000 rpm zentrifugieren. 

• NucleoSpin Extract Spin Column in ein neues 1.5 ml Reaktionsgefäß geben. 30 µl 

Puffer NE zugeben und 1 min bei Raumtemperatur inkubieren. 1 min bei 12.000 rpm 

zentrifugieren. 

11


2.3. Restriktions-Endonuklease-Verdau 

Material: 

Lösungen: 


Kolbenhub-Pipetten (20 µl) 


Hinf I (5 U/µl) Fa. MBI-Fermentas 

10 x Hinf I Puffer (= R + Puffer): 100 mM Tris-HCl (pH 8.5 at 37°C), 100 mM 

MgCl 2 , 1M KCl und 1mg/ml BSA (rot + markiert) 

Von den gereinigten Fragmenten (ca. 30 µl) werden 17 µl für den Hinf I Verdau verwendet 

und 7 µl werden als unverdaute Kontrolle im 3. Teil auf das Gel aufgetragen. 

Durchführung: 

• 17 µl gereinigtes PCR Produkt in ein neues 1.5 ml Reaktionsgefäß überführen 

• 2 µl 10 x Hinf I Puffer dazugeben (rot + markiert) 

• 1 µl Hinf I (5 U/µl) dazugeben 

• 20 µl gesamt 

• über Nacht bei 37 o C im Brutraum inkubieren ( = verdauter Ansatz) 

3. TEIL 

3.1. Agarose-Gelelektrophorese des Restriktionsverdaus 

Gerät: Spannungsquelle 

Minigel-Elektrophorese-Apparatur 

Transilluminator und Kamera 

Material: Agarosegel (aus dem Kühlschrank, am Vortag gegossen) 

Gelkassette 

Diskette (wird nicht zur Verfügung gestellt!) 




Lösungen: dH 2 O 

1 x TAE: 50 x TAE mit H 2 O verdünnen 

12


DNA-Längenstandard (50 ng/µl): 100 bp Leiter (GeneRuler 100bp DNA 

Ladder Plus – MBI Fermentas, www.fermentas.com ): starke Bande = 500 bp 

Ladepuffer: 6 x Orange Loading Dye (10 mM Tris-HCl, pH 7.6; 0.15% orange 

G, 0.03% xylene cyanol FF, 60% glycerol, 60 mM EDTA; Fa. MBI Fermentas) 

Die beiden Ansätze aus dem Brutraum holen und kurz abzentrifugieren. Von beiden Proben 

eine 1:100 Verdünnung herstellen (1 µl Probe + 99 µl dH 2 O) und davon 20 µl in ein neues 

1.5 ml Reaktionsgefäß geben. Die Verdünnung ist notwendig, da der Southern-Blot viel 

sensitiver ist als die Ethidiumbromid-Färbung. Die unverdauten Probe (jetzt 6 µl) werden mit 

13 µl dH 2 O verdünnt, und zu allen Proben werden 3 µl Ladepuffer dazugegeben. Die 

Agarose-Gelelektrophorese wird wie in Teil 2.1. beschrieben durchgeführt. 

500 ng Längenstandard (berechnen, wieviel µl dem entsprechen) mit 10 µl DIG-markierten 

Längenstandard mischen, und alles auf das Gel in die erste Tasche auftragen. 

• Auftrageschema: 

Spur 

1 500 ng Längenstandard mit 10 µl DIG- 

-markierter Standard mischen 

(x µl +10 µl) 

2 Frei 

3 Unverdaute Probe (22 µl) 

4 Verdaute Probe (22 µl) 

5 Frei 

6 Unverdaute Probe (1:100) (23 µl) 

7 Verdaute Probe (1:100) (23 µl) 

8 Frei 

9 Heterozygote Kontrolle verdaut (1:100) (23 µl) 

Eine Tasche freilassen und mit dem Auftrag der/s nächsten StudentIn fortfahren. 

• Proben bei 90 Volt 45 min (67,5 Vhs) laufen lassen (Gel wird anschließend für den 

Southern-Blot verwendet: 4.Teil ) 

4. TEIL 

4.1. Southern Blot Analyse 

Mit einer Southern Blot Analyse kann nicht nur die Identität eines PCR Produktes bzw. 

Restriktionsfragments festgestellt, sondern auch die Sensitivität um ca. 100.000 erhöht 

werden. Während mit dem DNA interkalierenden Fluoreszenzfarbstoff Ethidiumbromid nur 

doppelsträngige Nukleinsäuren ab ca. 10 - 20 ng sichtbar gemacht werden können, 

ermöglicht hingegen eine Southern Blot Analyse einzel– wie doppelsträngige DNA ab ca. 0.1 

pg zu detektieren. 

Bei einem Southern Blot werden einzelsträngige (denaturierte) DNA-Fragmente auf eine 

Trägermembran transferiert (Hintergrundliteratur in Kolloquiumsunterlagen B). Die auf der 

Membran immobilisierte DNA wird dann mittels Hybridisierung mit einer markierten Sonden 

DNA bzw. RNA sichtbar gemacht. 

13


In diesem Beispiel soll mit Hilfe einer κ-CN spezifischen Sonde, die komplementär zum 277 

bp Restriktionsfragment des κ-CN Genotyps A ist, hybridisiert werden. Diese Sonde 

detektiert auch das 409 bp Fragment des Genotyps B sowie das unverdaute PCR-Fragment. 

Wegen der hohen Sensitivität der Southern Blot Analyse werden auf das Agarosegel 1:100 

Verdünnungen der unverdauten bzw. verdauten Proben geladen. Zusätzlich wird als 

Positivkontrolle eine vom Tutor zur Verfügung gestellte 1:100 Verdünnung einer verdauten 

heterozygoten Spermienprobe aufgetragen. Damit die DNA-Fragmentgröße auf dem 

Southern Blot bestimmt werden kann, wird ein DIG-markierter DNA-Längenstandard 

ebenfalls auf das Agarosegel geladen: 

2.2 kb 

1.7 kb 

1.2 kb 

1 kb 

653 bp 

517 bp 

453 bp 

394 bp 

294 bp 

234 bp , 220 bp 

154 bp 

Gerät: 

Kreisschüttler 

Material: Agarosegel nach Gelelektrophorese 

ca. 15 x 10 cm große (= Gelgröße) positiv geladene Nylonmembran 

zehn 15 x 10 cm große (= Gelgröße) 3MM Filterpapiere schneiden 

pro Blot zwei 12 x 30 cm große 3MM Filterpapiere als Dochte 

Papierhandtücher (beim Tutor erhältlich) 

Frischhaltefolie 

Skalpell 

flache Pinzetten 

10 ml Glaspipetten 

Plastikwanne 

2 Glasplatten 

Gewicht (500 g, z.B. Pufferflaschen) 

Lösungen: 

500 ml Denaturierungslösung: 0.5 N NaOH, 1.5 M NaCl (frisch zubereiten und 

Einwaage im Protokoll angeben) 

14


500 ml 10 x SSPE Transferpuffer: Aus 20 x SSPE und sterilem dH 2 O herstellen 

20 x SSPE: 3.6 M NaCl 

0.2 M Na H 2 PO 4 /NaOH pH 7.4 

20 mM EDTA 

Der 20 x SSPE Puffer wird fallweise von den ÜbungsteilnehmerInnen hergestellt. 

In diesem Fall ist die Einwaage ins Protokoll aufzunehmen. 

4.2. Depurinierung und Denaturierung 

Kontrollierte Säurebehandlung depuriniert DNA, deren Doppelstränge sich in der folgenden 

Denaturierung lösen, sowie an den depurinierten Stellen brechen. Dadurch entstehen 

kleinere, leichter zu transferierende Fragmente. Depurinierung wird durchgeführt, wenn 

Fragmente größer als 10 kb übertragen werden sollen. In diesem Beispiel sind die PCR - 

Fragmente ca. 500 bp groß und daher entfällt der Depurinierungsschritt. 

• Das dokumentierte Gel wird 2 x 10 min in je 250 ml Denaturierungslösung am 

Kreisschüttler geschwenkt 

• danach mindestens 10 min in 200 ml 10 x SSPE bis zum Blottaufbau äquilibriert 

4.3. Kapillar-Blot-Aufbau 

Beim Kapillarblot wird die Sogwirkung von Filterpapieren ausgenützt, um DNA-Fragmente 

auf eine Trägermembran zu transferieren. 

• Aus 3MM Filterpapieren einen doppelten Docht schneiden, der größer als das Gel ist und 

in die Pufferlösung eintauchen muß. 

• Diesen gleichmäßig mit Transferpuffer befeuchten und so auf die Glasplatte ohne 

Luftblasen plazieren, dass die Enden in die Pufferlösung tauchen. 

• Das Gel an der rechten unteren Ecke schräg abschneiden und auf den Docht gleiten 

lassen. Damit der Blottaufbau über Nacht nicht umfällt, werden jeweils zwei Gele 

zusammen bzw. das "nicht- getrennte" Gel geblottet. 

• Gel und Wanne mit Frischhaltefolie abdecken und mit dem Skalpell über dem Gel die 

Folie ausschneiden und entfernen (also ein gel-großes Fenster schneiden). 

• Die gelgroße trockene positiv geladene Nylonmembran ohne Berührung im Idealfall mit 

flachen Pinzetten auf das Gel legen. Durch Abscheiden einer Ecke (wie beim Gel) 

markieren. Weiters kann die Membran mit Bleistift am Rand an der von der DNA/Gel 

abgewandten Seite mit "back" bzw. Gruppenkürzel beschriftet werden. 

15


• Membran nochmals mit ca. 5 ml 10 x SSPE Puffer befeuchten. 

• Drei in 10 x SSPE befeuchtete gel-große 3MM Filterpapiere vorsichtig auf die Membran 

legen. 

• Mit einer Glaspipette die eventuell unter der Membran liegenden Luftblasen ausstreichen. 

• ca. 7 weitere trockene gel-große 3MM Filterpapiere auflegen 

• Darauf eine ca. 5 cm hohe Schicht von ebenfalls gel-großen Papierhandtücher plazieren 

und mit einer Glasplatte gleichmäßig (Wasserwaage!!) beschweren, auf der wiederum ein 

ca. 0.5 kg schweres Gewicht (Pufferflasche) gestellt wird. Diese Flasche mit dem 

Metallring gegen ein Umfallen sichern. 

Die Gelvorbehandlung mit dem Blottaufbau sollte nicht länger als 2 Stunden benötigen. 

Der DNA Transfer dauert mindestens 4 Stunden und am besten über Nacht. 

4.4. DNA-Fixierung auf die Membran 

• Den Blott abbauen und die DNA mit Hilfe des UV-Transilluminators auf der 

Nylonmembran "Crosslinken". Dafür wird der Transilluminator mit Frischhaltefolie 

abgedeckt und die Nylonmembran von jeder Seite 3 min mit 265 nm od. 302 nm 

bestrahlen. (Bitte auf den Selbstschutz nicht vergessen und entweder den Raum 

verlassen oder den UV-Schutz tragen). 

Die so auf die Membran fixierten DNA Fragmente können trocken mehrere Monate gelagert 

werden. Im vorliegenden Beispiel wird die Membran gleich hybridisiert. 

5. TEIL 

5.1. Hybridisierung 

Geräte: 

Material: 

Lösungen: 

Hybridisierungsofen auf 42°C vorheizen 

Wasserbad auf 68°C vorheizen 

10 ml Glaspipetten 

Pipettierhilfe 

Deckelschalen 

ca. 8 ml Vorhybridisierungslösung (EasyHyb von Roche Diagnostics) 

ca. 8 ml Haupthybridisierungslösung mit 5 - 25 ng/ml DIG-markierter κ-CN 

Sonde 

Bitte in Kolloquiumsunterlagen nachlesen, wie Sonden hergestellt werden können, und was 

die Sensitivität bzw. Spezifität einer Sonde beeinflußt. Welche Markierungsmöglichkeiten gibt 

es außer dem Digoxigeninsystem? 

• Membran in gutschließende, rechteckige Plastik-Deckelschale legen und mit 8 ml 

Vorhybridisierungslösung ca. 30 min bei 42°C vorhybridisieren lassen. 

• In der Zwischenzeit Hybridisierunglösung ca. 10 min auf 68 °C aufheizen. 

• Vorhybridisierungslösung mittels Trichter in Plastikflasche zurückschütten, da sie ca. 5 - 

10 mal wiederverwendet werden kann. 

16


• Erwärmte Hybridisierungslösung zur Membran schütten und über Nacht bei 42°C 

hybridisieren lassen. Mit Parafilm schließen und vor Austrocknung schützen. 

• Für den Blottabbau bis zur Haupthybridisierung sollten nicht mehr als 1 1/2 Stunden 

benötigt werden. 

Damit der Freitag nicht zu lang wird, müssen die Waschpuffer für Freitag herstellt werden. 

Einwaagen protokollieren. Falls Sie sich mit der Berechnung unsicher sind, fragen Sie bitte 

den/die TutorIn. 

Wichtig: Membran darf ab der Hybridisierung nie mehr austrocknen und sollte immer feucht 

bleiben. 

Was beeinflußt die Hybridstabilität und was die Hybridisationsrate? 

17


6. TEIL 

6.1. Bestimmung der Genotpyen mittels Sequenzanalyse 

Die Ergebnisse der Sequenzanalyse (Chromatogramme) erhalten Sie während des 

Beispiels. Zur Erläuterung: An Position 134 von Primer JK 501 aus gerechnet, ist bei 

Genotyp A eine Punktmutation vorhanden. Die Sequenz lautet: 5`-gaagAttct -`3. Genotyp B 

besitzt die Sequenz: 5`-gaagCttct -`3. Bei einem heterozygoten Individuum überlagern sich 

an der entsprechenden Position 2 Peaks. (Am Chromatogramm sind die ersten 10-20 Basen 

gar nicht oder nur schlecht zu lesen.) 

6.2. Sequenzvergleiche in einer Datenbank 

PCs im 6. Stock (EDV-Raum) benützen! 

In internationalen Datenbanken läßt sich eruieren, ob es bereits verwandte (homologe) oder 

idente Sequenz-Daten gibt. Grundsätzlich gibt es zwei Arten zu suchen: 

• Man sucht mit einem bestimmten Schlagwort (Keyword). Dafür eignet sich die 

Schablone aus der NCBI Datenbank unter der Internet-Adresse: 

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/ 

Im Feld „Search“ gibt man „nucleotide“ ein; im Feld daneben das gesuchte 

Schlagwort (z.B. bovine kappa casein). 

• Weitere Informationen finden Sie unter: 

Datenbanken/NCBI: 

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query/static/help/helpdoc.html#Introduction 

Literatursuche: Pubmed - 

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?rid=helppubmed.section.pubmedhelp.Searching_PubM 

ed#pubmedhelp.A_basic_search 

Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) 

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=pubmed&list_uids=15215342&dopt=Citation 

• Diese Datenbank verknüpft nicht nur Sequenzdaten mit Stichworten, sondern es ist 

auch möglich Literatur abzufragen. Dafür muß im Feld „Search“ die jeweilige 

Datenbank angewählt werden. 

• Weiteres ist es möglich mit Hilfe einer speziellen Suchmaschine (i.e. BLAST = Basic 

Local Alignment Search Tool" Sequenzdatenbanken abzufragen und nach 

Homologen zu suchen. Für die Sequenzabfrage (Aminosäure- oder Nukleotid- 

Sequenz) kann die Schablone unter der Internet-Adresse 

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ „Basic BLAST search“ verwendet werden. 

Tippen Sie einen Teil der erhaltenen Sequenz (30-50 bp) in das entsprechende Feld und 

starten Sie die Abfrage durch Anklicken des Feldes „search“ am Ende der Seite. (Die 

Prozedur kann ein paar Minuten dauern, je nachdem, wie stark der Server gerade 

18


frequentiert wird. Da die USA vormittags schlafen, ist man zu dieser Zeit meistens 

schneller.) 

• Inkludieren Sie in Ihr Protokoll die Ergebnisse der Datenbanksuchen. Mit welcher 

Datenbanksuche konnten mehr κ-CN Sequenzen gefunden werden? Wurden die 

gleichen Sequenzen identifiziert? Wieviel κ-CN Allele sind in der Datenbank zu finden? 

Auf welchem Exon liegt die Mutation, die Allele A von B unterscheidet? Wurden 

homologe Sequenzen von anderen Organismen gefunden? Was sind die letzten 

Publikationen über das "bovine kappa casein"? 

19


7. TEIL 

7.1. Waschen der hybridisierten Membran 

Geräte: 

Material: 

Lösungen: 

Schüttelwasserbad auf 60°C vorheizen 

Taumelschüttler 

Plastikwannen 

200 ml Waschlösung I: 2 x SSC, 0.1 % SDS (am Vortag hergestellt) 

200 ml Waschlösung II: 0.1 x SSC, 0.1 % SDS (am Vortag hergestellt) 

Arbeitsanleitung: 

20 x SSC: 3.0 M NaCl 

0.3 M Tri-Natriumcitrat pH 7.0 

Der 20 x SSC Puffer wird fallweise von den ÜbungsteilnehmerInnen hergestellt. 


20 % (w/v) SDS (Sodium/Natrium-dodecyl-sulfat) Lösung 

• Hybridisierungslösung in Röhrchen zurückschütten und bis zur Wiederverwendung bei 

-20°C einfrieren. 

• Membran in Plastikwanne legen und 3 x in 50 ml Waschlösung I bei Raumtemperatur je 5 

min am Kreisschüttler schwenken. 

• Waschlösung I abschütten und 2 x in 50 ml vorgewärmter Waschlösung II bei 60°C je 15 

min im Schüttelwasserbad waschen. 

7.2. Immundetektion 

Geräte: 

Material: 

Lösungen: 

37°C Brutraum 

Taumelschüttler 

Folienschweißgerät 

quadratische Petrischalen (12 x 12 cm) 

Folien 

Röntgenkassette 

Röntgenfilm 

10 % (w/v) steriles Blockierungsreagenz in Puffer 1 (Stammlösung) 

Puffer 1: 200 ml 0.1 M Maleinsäure/NaOH pH 7.5 

0.15 M NaCl 

Der Puffer 1 wird fallweise von den ÜbungsteilnehmernInnen hergestellt. 


Puffer 2: 45 ml 1 % (v/v) Blockierungsreagenz in Puffer 1. Diese Lösung 

wird aus der 10 % Stammlösung durch eine 1:10 

Verdünnung hergestellt. 

Blockierungslösung: Von den 45 ml werden 25 ml für die Blockierung des 

Blottes verwendet und aus den restlichen 20 ml wir die 

Antikörperlösung hergestellt. 

Antikörperlösung: 20 ml Puffer 2 und 2 µl Anti-DIG-AP-Stammlösung 

20


Arbeitsanleitung: 

Puffer 3: 20 ml 0.1 M Tris/HCl pH 9.5 

0.1 M NaCl 

Der Puffer 3 wird fallweise von den ÜbungsteilnehmernInnen hergestellt. 


200 µl Chemieluminiszenzsubstrat: CSPD "ready-to-use" 

Entwickler 

Fixierer 

• Nach dem letzten Waschschritt Membran ca. 2 min in ca. 50 ml Puffer 1 am Kreisschüttler 

schwenken. Darauf achten, dass die Membranen nicht übereinander zu liegen kommen. 

• Puffer 1 abschütten und 30 min mit 25 ml Puffer 2 unter Schwenken blockieren, danach 

wird die Blockierungslösung weggeschüttet. 

• Von der Oberfläche der Anti-DIG-AP-Konjugat-Stammlösung 2 µl zu 20 ml Puffer 2 pipettieren 

(1:10.000). 

• Membran 30 min in der Anti-DIG-AP-Lösung am Kreisschüttler schwenken. Darauf 

achten, dass die Membranen nicht übereinander zu liegen kommen. 

• Membran in frische/gut gewaschene Plastikpetrischale mit 2 x 50 ml Puffer 1 je 15 min 

schwenken. Darauf achten, dass die Membranen nicht übereinander zu liegen kommen. 

• Membran für 2 min in 20 ml Puffer 3 äquilibrieren. 

• Das Chemieluminiszenzsubstrat (ca. 200 µl CSPD „ready to use“) auf eine 

Einschweißfolie tröpfeln. Die Membran möglichst ohne Luftblasen (DNA-Seite zum 

Substrat zugewandt – i.e. nach unten) drauf legen, mit einer zweiten Folie abdecken und 

das Substrat gleichmäßig verteilen. Das gelingt am besten mit einem Papiertuch, welches 

mit sanften Druck auf der Einschweißfolie kreisförmig bewegt wird. 

• Nach 5 min Inkubation überschüssige Flüssigkeit kräftig ausstreichen, die Ränder der Folie 

verschweißen und 1 – 1.5 Std. bei 37°C (im Brutraum) gleich mit einem Röntgenfilm 

exponieren. Die Dauer der Exposition ist von der Bandenintensität des Agarosegels und von 

der Bloteffizienz abhängig. Die Betreuerin und TutorInnen stehen Ihnen zur Verfügung, die 

Expositionszeit abzuschätzen. 

• Der Röntgenfilm bzw. die Röntgenfilmkassette darf nur im dunkeln Raum mit rotem 

Schutzlicht geöffnet und manipuliert werden. 

• Für die Entwicklung des Films wird der Entwickler (schwarze Wanne), Wasser (weiße 

Wanne) und Fixierer (rote Wanne) aus den Vorratsgefäßen in die jeweils dafür 

vorgesehenen Wannen fingerhoch geschüttet. Wenn der Film aus der Kassette genommen 

wird, darf nur noch das Sicherheitslicht (Rotlicht) den Dunkelraum beleuchten. 

• Film zuerst in den Entwickler legen, 1-3 min warten, danach mit einer Pinzette ins Wasser 

transferieren (ca. 30 sec) und als letztes in den Fixierer legen. Nach ca. 30 sec ist der Film 

fixiert, und das Licht kann wieder angeschaltet bzw. der Raum geöffnet werden. 

• Den Film wieder mit Wasser spülen und abtropfen lassen. Da die Gelatineoberfläche 

empfindlich ist, bitte den Film nur Lufttrocknen lassen. Erst wenn er vollständig trocken ist, 

kann er beschriftet und transportiert werden. 

• Die verwendeten Lösungen wieder in die Vorratsgefäße zurückschütten, da diese mehrmals 

verwendet werden können. Ein Austausch ist erst notwendig, wenn der Entwickler eine 

braun-graue Farbe angenommen hat. 

21


Weitere Hinweise 

• Das Protokoll soll spätestens 3 Wochen nach dem praktischen Teil abgegeben werden. 

Eine unentschuldigte spätere Abgabe, verschlechtert die Benotung. 

• Im Protokoll sollen unbedingt die tatsächlichen Bedingungen inkl. verwendeten Geräte 

aufgeführt werden. 

• Das Ziel des Beispiels ist die eindeutige Bestimmung des Genotyps auf dem Sequenz- 

Chromatogramm sowie der Stier-Sperma-Probe mittels Restriktionsverdau und Southern- 

Blot Analyse. 

• Alle Ergebnisse müssen dokumentiert und interpretiert werden. 

• Legen Sie Ihrem Protokoll die originalen Fotos der Agarose-Gelelektrophorese bei. 

• Legen Sie Ihrem Protokoll den originalen Röntgenfilm bei. 

• Auf jedem Röntgenfilm sollen die Banden identifiziert und beschriftet sowie die 

Expositionszeit, Konzentration und Identität der Sonde angegeben werden. 

• Jede Abbildung hat eine Legende mit Titel und Kurzbeschreibung. Diese sollte so genau 

sein, daß die Aussage der Abbildung verstanden werden kann, ohne im Text nachlesen 

zu müssen. 

• Geben Sie bitte immer die Größe der DNA Fragmente in der Abbildung an. 

• Zeichnen Sie in das Chromatogramm den Sequenzabschnitt ein, welcher für die 

Genotypisierung charakteristisch ist. Was ist die Erkennungssequenz des Hinf I Enzyms? 

• Falls Sie Probleme haben, zögern Sie bitte nicht, den/die TutorIn oder die 

verantwortlichen AssistentInnen (Dr. Richard Strasser, Zi. 04/69; Dr. Marie-Theres Hauser 

Zi. 04/03.2) zu fragen. 

• Weitere Hinweise zur Laborjournal- und Protokollführung http://www.dapp.boku.ac.at 

/5679.html und http://www.dapp.boku.ac.at/fileadmin/_/H95/H954/pdf/LV_Nr.954101 

/Verhalten/Laborverhalten_01.pdf 

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Determination of Bovine Kappa-Casein Genotype by PCR ... - Boku

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