Determination of Bovine Kappa-Casein Genotype by PCR ... - Boku
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Molekularbiologische Übungen I Beispiel Genotyp Version: 02.10.2008<br />
Ethidiumbromid-Lösung (10 mg/ml) in dH 2 O (Achtung GIFTIG!)<br />
DNA-Längenstandard (50 ng/µl): 100 bp Leiter (GeneRuler 100 bp DNA<br />
Ladder Plus – Fa. MBI Fermentas, www.fermentas.com ): starke Bande = 500<br />
Basenpaare (bp)<br />
Ladepuffer: 6 x Orange Loading Dye (10 mM Tris-HCl, pH 7.6; 0.15% orange<br />
G, 0.03% xylene cyanol FF, 60% glycerol, 60 mM EDTA; Fa. MBI Fermentas)<br />
Gießen des Agarosegeles (ein Gel für 6 Studenten – teilweise stehen die Agarosegele<br />
bereits zur Verfügung )<br />
• Die Gelkassette wird an den Enden mit einem Klebeband abgedichtet, damit das<br />
aufgeschmolzene Agarosegel nicht ausfließen kann (vorher Gelkassette an den Rändern<br />
mit EtOH entfetten).<br />
• 1.5 g Agarose werden in einen 250 ml Kolben eingewogen<br />
• 100 ml 1 x TAE Puffer dazugeben<br />
• Der Kolben wird mit einer Frischhaltefolie, (kein Alu!) in die einige Löcher gestochen<br />
werden, verschlossen<br />
• Agarose wird in der Mikrowelle aufgeschmolzen bis keine Schlieren mehr sichtbar sind<br />
(Kolben mehrmals aus dem Ofen nehmen und leicht schütteln)<br />
• Nach dem Abkühlen der Lösung auf ca. 60-55 o C 7 µl Ethidiumbromid Lösung dazu<br />
geben und gut durchmischen<br />
Vorsicht Ethidiumbromid ist GIFTIG (starkes MUTAGEN)! Es muss unbedingt mit<br />
Handschuhen gearbeitet werden!<br />
• Anschließend die Lösung vorsichtig in entsprechende Gelkassette gießen (luftblasenfrei),<br />
der Kamm zur Formung der Geltaschen wird vorsichtig eingesetzt (20-Taschen-Kamm)<br />
• Gel bei Raumtemperatur erstarren lassen (Minimum 30 min)<br />
• Gele können auch mit Kollegen geteilt werden. Es ist vorteilhaft gleich das Gel das in<br />
Punkt 3.1. gebraucht wird mitzugießen, pro Student werden 10 Taschen benötigt. Gele<br />
halten im Kühlschrank in Frischhaltefolie einwickelt mehrere Tage.<br />
Auftragen der Proben und Elektrophorese:<br />
• Erstarrtes Agarosegel in die Elektrophorese-Apparatur so einlegen, dass die DNA in<br />
Richtung Anode (von Schwarz nach Rot) wandern kann. Mit 1 x TAE überschichten<br />
(Taschen müssen mit Flüssigkeit bedeckt sein)<br />
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