Determination of Bovine Kappa-Casein Genotype by PCR ... - Boku

Molekularbiologische Übungen I Beispiel Genotyp Version: 02.10.2008
DNA-Längenstandard (50 ng/µl): 100 bp Leiter (GeneRuler 100bp DNA
Ladder Plus – MBI Fermentas, www.fermentas.com ): starke Bande = 500 bp
Ladepuffer: 6 x Orange Loading Dye (10 mM Tris-HCl, pH 7.6; 0.15% orange
G, 0.03% xylene cyanol FF, 60% glycerol, 60 mM EDTA; Fa. MBI Fermentas)
Die beiden Ansätze aus dem Brutraum holen und kurz abzentrifugieren. Von beiden Proben
eine 1:100 Verdünnung herstellen (1 µl Probe + 99 µl dH 2 O) und davon 20 µl in ein neues
1.5 ml Reaktionsgefäß geben. Die Verdünnung ist notwendig, da der Southern-Blot viel
sensitiver ist als die Ethidiumbromid-Färbung. Die unverdauten Probe (jetzt 6 µl) werden mit
13 µl dH 2 O verdünnt, und zu allen Proben werden 3 µl Ladepuffer dazugegeben. Die
Agarose-Gelelektrophorese wird wie in Teil 2.1. beschrieben durchgeführt.
500 ng Längenstandard (berechnen, wieviel µl dem entsprechen) mit 10 µl DIG-markierten
Längenstandard mischen, und alles auf das Gel in die erste Tasche auftragen.
• Auftrageschema:
Spur
1 500 ng Längenstandard mit 10 µl DIG-
-markierter Standard mischen
(x µl +10 µl)
2 Frei
3 Unverdaute Probe (22 µl)
4 Verdaute Probe (22 µl)
5 Frei
6 Unverdaute Probe (1:100) (23 µl)
7 Verdaute Probe (1:100) (23 µl)
8 Frei
9 Heterozygote Kontrolle verdaut (1:100) (23 µl)
Eine Tasche freilassen und mit dem Auftrag der/s nächsten StudentIn fortfahren.
• Proben bei 90 Volt 45 min (67,5 Vhs) laufen lassen (Gel wird anschließend für den
Southern-Blot verwendet: 4.Teil )
4. TEIL
4.1. Southern Blot Analyse
Mit einer Southern Blot Analyse kann nicht nur die Identität eines PCR Produktes bzw.
Restriktionsfragments festgestellt, sondern auch die Sensitivität um ca. 100.000 erhöht
werden. Während mit dem DNA interkalierenden Fluoreszenzfarbstoff Ethidiumbromid nur
doppelsträngige Nukleinsäuren ab ca. 10 - 20 ng sichtbar gemacht werden können,
ermöglicht hingegen eine Southern Blot Analyse einzel– wie doppelsträngige DNA ab ca. 0.1
pg zu detektieren.
Bei einem Southern Blot werden einzelsträngige (denaturierte) DNA-Fragmente auf eine
Trägermembran transferiert (Hintergrundliteratur in Kolloquiumsunterlagen B). Die auf der
Membran immobilisierte DNA wird dann mittels Hybridisierung mit einer markierten Sonden
DNA bzw. RNA sichtbar gemacht.
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