Determination of Bovine Kappa-Casein Genotype by PCR ... - Boku

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Molekularbiologische Übungen I Beispiel Genotyp Version: 02.10.2008 • Membran nochmals mit ca. 5 ml 10 x SSPE Puffer befeuchten. • Drei in 10 x SSPE befeuchtete gel-große 3MM Filterpapiere vorsichtig auf die Membran legen. • Mit einer Glaspipette die eventuell unter der Membran liegenden Luftblasen ausstreichen. • ca. 7 weitere trockene gel-große 3MM Filterpapiere auflegen • Darauf eine ca. 5 cm hohe Schicht von ebenfalls gel-großen Papierhandtücher plazieren und mit einer Glasplatte gleichmäßig (Wasserwaage!!) beschweren, auf der wiederum ein ca. 0.5 kg schweres Gewicht (Pufferflasche) gestellt wird. Diese Flasche mit dem Metallring gegen ein Umfallen sichern. Die Gelvorbehandlung mit dem Blottaufbau sollte nicht länger als 2 Stunden benötigen. Der DNA Transfer dauert mindestens 4 Stunden und am besten über Nacht. 4.4. DNA-Fixierung auf die Membran • Den Blott abbauen und die DNA mit Hilfe des UV-Transilluminators auf der Nylonmembran "Crosslinken". Dafür wird der Transilluminator mit Frischhaltefolie abgedeckt und die Nylonmembran von jeder Seite 3 min mit 265 nm od. 302 nm bestrahlen. (Bitte auf den Selbstschutz nicht vergessen und entweder den Raum verlassen oder den UV-Schutz tragen). Die so auf die Membran fixierten DNA Fragmente können trocken mehrere Monate gelagert werden. Im vorliegenden Beispiel wird die Membran gleich hybridisiert. 5. TEIL 5.1. Hybridisierung Geräte: Material: Lösungen: Hybridisierungs<strong>of</strong>en auf 42°C vorheizen Wasserbad auf 68°C vorheizen 10 ml Glaspipetten Pipettierhilfe Deckelschalen ca. 8 ml Vorhybridisierungslösung (EasyHyb von Roche Diagnostics) ca. 8 ml Haupthybridisierungslösung mit 5 - 25 ng/ml DIG-markierter κ-CN Sonde Bitte in Kolloquiumsunterlagen nachlesen, wie Sonden hergestellt werden können, und was die Sensitivität bzw. Spezifität einer Sonde beeinflußt. Welche Markierungsmöglichkeiten gibt es außer dem Digoxigeninsystem? • Membran in gutschließende, rechteckige Plastik-Deckelschale legen und mit 8 ml Vorhybridisierungslösung ca. 30 min bei 42°C vorhybridisieren lassen. • In der Zwischenzeit Hybridisierunglösung ca. 10 min auf 68 °C aufheizen. • Vorhybridisierungslösung mittels Trichter in Plastikflasche zurückschütten, da sie ca. 5 - 10 mal wiederverwendet werden kann. 16
Molekularbiologische Übungen I Beispiel Genotyp Version: 02.10.2008 • Erwärmte Hybridisierungslösung zur Membran schütten und über Nacht bei 42°C hybridisieren lassen. Mit Parafilm schließen und vor Austrocknung schützen. • Für den Blottabbau bis zur Haupthybridisierung sollten nicht mehr als 1 1/2 Stunden benötigt werden. Damit der Freitag nicht zu lang wird, müssen die Waschpuffer für Freitag herstellt werden. Einwaagen protokollieren. Falls Sie sich mit der Berechnung unsicher sind, fragen Sie bitte den/die TutorIn. Wichtig: Membran darf ab der Hybridisierung nie mehr austrocknen und sollte immer feucht bleiben. Was beeinflußt die Hybridstabilität und was die Hybridisationsrate? 17
Seite 1 und 2: Molekularbiologische Übungen I Bei
Seite 15: Molekularbiologische Übungen I Bei

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