Determination of Bovine Kappa-Casein Genotype by PCR ... - Boku

Molekularbiologische Übungen I Beispiel Genotyp Version: 02.10.2008
Einführung
Unter Caseinen versteht man eine Familie von Milchproteinen (alpha, beta, und kappa-
Caseine), die in mehreren Allel-Varianten vorkommen. Kappa-Caseine (κ-CN) zum Beispiel
existieren in verschiedenen allelischen Formen (z.B. Allele A, B, C, E), die einen besonderen
Einfluß bei der Milch- und Käseproduktion haben. Daher werden bestimmte Genotypen für
die Zucht bevorzugt.
Im vorliegenden Beispiel wird eine Methode beschrieben, die eine rasche und zuverlässige
Genotypisierung der Rinder κ-CN Allele erlaubt. Im Gegensatz zur direkten Analyse von
Milchproteinen erlaubt diese Methode eine Genotypisierung direkt aus Spermazellen, Blut
oder Gewebe. Ein 494 Basenpaare (bp) langes DNA-Fragment des Rinder κ-CN-Gens wird
aus Stier-Spermazellen mittels Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) amplifiziert und einem
Restriktionsverdau unterzogen. Die Identität des PCR-Produktes bzw. DNA-Fragmentes
kann mit Hilfe einer Sequenz-Analyse und anschließendem Datenbankvergleich sowie mit
einem Southern-Blot bestätigt werden.
Im vorliegenden Beispiel soll A) mittels Restriktionsverdaus eine Identifizierung des κ-CN AA,
AB oder BB Genotyps durchgeführt werden,
B) die Identität der Restriktionsfragmente mittels Southern Blot
bestimmt werden und
C) der Unterschied zwischen AA, AB oder BB Genotypen auf
einem Sequenzanalyse-Chromatogramm festgestellt sowie
D) eine Datenbanksuche durchgeführt werden.
Aufgund einer Punktmutation in der DNA-Sequenz an Position 274 des PCR Produktes in
Allel A entsteht eine zusätzliche Hinf I Schnittstelle, die in Allel B nicht vorkommt. Diese
Schnittstelle kann daher verwendet werden um zwischen den κ-CN Genotypen A und B zu
unterscheiden. Nach erfolgtem Hinf I Verdau erhält man je nach Genotyp unterschiedlich
lange Fragmente bzw. eine unterschiedliche Anzahl von Fragmenten.
JK500
JK302
*
277 bp 85 bp
132 bp
Hinf I (A) Hinf I (A, B)
Schematische Darstellung des PCR Produktes (494 bp) von Allel A und B (* =
Punktmutation) amplifiziert mit Primer JK500 und JK302. Der grüne Balken markiert die
Sonde, die bei der Southern Blot Analyse verwendet wird.
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