Determination of Bovine Kappa-Casein Genotype by PCR ... - Boku

Molekularbiologische Übungen I Beispiel Genotyp Version: 02.10.2008
500 ml 10 x SSPE Transferpuffer: Aus 20 x SSPE und sterilem dH 2 O herstellen
20 x SSPE: 3.6 M NaCl
0.2 M Na H 2 PO 4 /NaOH pH 7.4
20 mM EDTA
Der 20 x SSPE Puffer wird fallweise von den ÜbungsteilnehmerInnen hergestellt.
In diesem Fall ist die Einwaage ins Protokoll aufzunehmen.
4.2. Depurinierung und Denaturierung
Kontrollierte Säurebehandlung depuriniert DNA, deren Doppelstränge sich in der folgenden
Denaturierung lösen, sowie an den depurinierten Stellen brechen. Dadurch entstehen
kleinere, leichter zu transferierende Fragmente. Depurinierung wird durchgeführt, wenn
Fragmente größer als 10 kb übertragen werden sollen. In diesem Beispiel sind die PCR -
Fragmente ca. 500 bp groß und daher entfällt der Depurinierungsschritt.
• Das dokumentierte Gel wird 2 x 10 min in je 250 ml Denaturierungslösung am
Kreisschüttler geschwenkt
• danach mindestens 10 min in 200 ml 10 x SSPE bis zum Blottaufbau äquilibriert
4.3. Kapillar-Blot-Aufbau
Beim Kapillarblot wird die Sogwirkung von Filterpapieren ausgenützt, um DNA-Fragmente
auf eine Trägermembran zu transferieren.
• Aus 3MM Filterpapieren einen doppelten Docht schneiden, der größer als das Gel ist und
in die Pufferlösung eintauchen muß.
• Diesen gleichmäßig mit Transferpuffer befeuchten und so auf die Glasplatte ohne
Luftblasen plazieren, dass die Enden in die Pufferlösung tauchen.
• Das Gel an der rechten unteren Ecke schräg abschneiden und auf den Docht gleiten
lassen. Damit der Blottaufbau über Nacht nicht umfällt, werden jeweils zwei Gele
zusammen bzw. das "nicht- getrennte" Gel geblottet.
• Gel und Wanne mit Frischhaltefolie abdecken und mit dem Skalpell über dem Gel die
Folie ausschneiden und entfernen (also ein gel-großes Fenster schneiden).
• Die gelgroße trockene positiv geladene Nylonmembran ohne Berührung im Idealfall mit
flachen Pinzetten auf das Gel legen. Durch Abscheiden einer Ecke (wie beim Gel)
markieren. Weiters kann die Membran mit Bleistift am Rand an der von der DNA/Gel
abgewandten Seite mit "back" bzw. Gruppenkürzel beschriftet werden.
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