Determination of Bovine Kappa-Casein Genotype by PCR ... - Boku

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Molekularbiologische Übungen I Beispiel Genotyp Version: 02.10.2008 1.2. Durchführung der PCR Da es sich bei der PCR um eine sehr starke Anreicherung bestimmter DNA Stücke handelt (von einem Molekül können bis zu 10 8 Moleküle amplifiziert werden), kommt es häufig zu Kontaminationen. Daher ist es bei diesem Schritt besonders wichtig, sauber und genau zu arbeiten. Gerät: Material: Lösungen: Thermocycler (für 0.3 ml Reaktionsgefäße) Reaktionsgefäße (0.3 ml) Kolbenhub-Pipetten (200 µl, 20 µl) gelbe Pipettenspitzen dH 2 O (sterile deionized water) 10 x PCR-Puffer: 100 mM Tris, pH 8.8, 500 mM KCl, 15 mM MgCl 2 , 1% Triton 10 mM dNTP Mix (10 mM of each dATP, dCTP, dGTP, dTTP) Primer JK500 (20 µM bzw. 20 pmol/µl); JK302 (20 µM) Taq DNA-Polymerase (~5 U/µl) Positiv-Kontrolle: gereinigtes kappa-Casein 494 bp DNA-Fragment (~0.25pg/µl) Pro Person werden 5 Ansätze á 25 µl DNA (entsprechende Verdünnung) + 25 µl PCR- Prämix gemacht. PCR-Prämix (Reihenfolge einhalten): 103,0 µl dH 2 O 30,0 µl 10 x PCR Puffer 3,0 µl dNTP Mix (je 10mM) 6,0 µl Primer JK 500 (20 pmol/µl) 6,0 µl Primer JK 302 (20 pmol/µl) vortexen 2,0 µl Taq Polymerase (~5 U/µl) 150,0 µl Gesamt (gut mischen, nicht vortexen) PCR- Ansätze: • Zu den Eppendorfhütchen 1-5, in denen sich bereits 25 µl DNA Verdünnungen (bzw. nur dH 2 O im Ansatz 4) befinden, werden 25 µl PCR-Prämix gegeben. PCR-Prämix zuerst zu 1-4 dazugeben und zum Schluß zu 5, um eine Kontamination mit der Positiv-Kontrolle zu vermeiden. 6
Molekularbiologische Übungen I Beispiel Genotyp Version: 02.10.2008 • Vorsichtig durchmischen, kurz abzentrifugieren Auf Thermocycler I stellen, Programm CHRMO wählen (Laufzeit: ca. 2,5h) (Programm mit Heizdeckel) Bei Programm CHRMO werden folgende Zyklen gefahren: 1. initial Denaturation 2 min 95 o C 2. Denaturation 45 sec 94 o C 3. Annealing 1 min 50 o C 4. Polymerisation 45 sec 72 o C Schritte 2-4 werden 30 x wiederholt (= 30 Zyklen) 5. final Polymerisation 8 min 72 o C 6. HOLD at 4°C HOLD 4°C 2. TEIL 2.1. Überprüfung der PCR mittels Agarose-Gelelektrophorese Zum Nachweis der Amplifizierung wird der Reaktionsansatz auf einem sogenannten Agarose-Minigel, in dem sich der fluoreszierende, DNA interkalierende Farbstoff Ethidiumbromid befindet, analysiert. Da das erwartete PCR Produkt nur 494 Basenpaare (bp) lang ist, soll ein 1,5%iges Agarosegel verwendet werden. Gerät: Material: Lösungen: Mikrowelle Spannungsquelle Minigel-Elektrophorese-Apparatur Transilluminator und Kamera Agarose Erlenmeyerkolben (250 ml) Frischhaltefolie Klebeband Kamm und Gelkassette USB-Stick mitnehmen Reaktionsgefäße (1.5 ml) Kolbenhub-Pipetten (200 µl, 20 µl) Gelbe Pipettenspitzen 50 x TAE (100 ml: 24.2 g Tris, 5.71 ml 100 %ige Essigsäure, 10 ml 0.5 M EDTA) 1 x TAE: 50 x TAE mit H 2 O verdünnen 7
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