Determination of Bovine Kappa-Casein Genotype by PCR ... - Boku

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Molekularbiologische Übungen I Beispiel Genotyp Version: 02.10.2008 • Gele unter UV-Licht am Transilluminator betrachten. Bild mittels Kamera aufnehmen, ausdrucken und auf eine Diskette speichern. Jene beiden Proben, die das meiste PCR Produkt (494 bp) aufweisen, werden gereinigt (siehe 2.2.) und für den Restriktionsverdau und den darauffolgenden Southern-Blot verwendet. 2.2. Reinigung der PCR-Fragmente mittels Gel Extraction Kit Für Restriktionsenzymanalysen, Sequenzierreaktionen und auch für den nachfolgenden Southern-Blot ist es günstig, wenn man reine PCR Fragmente - vor allem ohne der nicht verbrauchten Primer - verwendet (beim Southern-Blot könnte es zu unspezifischen Hybridisierungsreaktionen kommen). Daher ist es notwendig die amplifizierten PCR Stücke aus dem Agarosegel zu reinigen. Gerät: Material: Lösungen: UV-Transilluminator Waage Thermoblock Tischzentrifuge Mini-shaker (zum „Vortexen“) Skalpell Reaktionsgefäße (1.5 ml) Kolbenhub-Pipetten (1000 µl, 200 µl, 20 µl) Blaue und Gelbe Pipettenspitzen NucleoSpin Extract Kit (Firma Macherey-Nagel) • Jene 2 Proben, die das meiste PCR-Produkt auf einer Höhe von 494 bp aufweisen, werden für die Reinigung verwendet. Die DNA-Banden werden unter UV-Licht möglichst rasch mit einem Skalpell aus dem Gel geschnitten (nur wenig Gel, welches keine DNA enthält, mitschneiden, Vorsicht: nicht den Transilluminator beschädigen!) Gewicht des Reaktionsgefäßes nicht mitrechnen! Falls nur die Positiv-Kontrolle sichtbar ist, wird diese ausgeschnitten und gereinigt. Falls keine eigenen Banden vorhanden sind, wird entweder eine Bande (z.B. Positiv-Kontrolle) eines Kollegen ausgeschnitten und damit weitergearbeitet oder falls dies nicht möglich ist, wird eine Ersatzprobe (= eingefrorenes Gelstück) vom Tutor ausgegeben. Bei längerer Exposition am UV-Transilluminator werden DNA-Fragmente zerstört (UVcrosslinking, Mutagenese) und deren Sichtbarkeit verringert. 10
Molekularbiologische Übungen I Beispiel Genotyp Version: 02.10.2008 Vor dem Ausschneiden das Gewicht eines leeren 1.5 ml Reaktionsgefäß mittels Waage bestimmen und notieren. Vorgang der Reinigung wie folgt (siehe auch E. coli Protokoll): • Die DNA-Bande wird mit einer sauberen Klinge aus dem Gel geschnitten (so wenig überschüssiges Gel wie möglich mitschleppen, das Gel sollte nicht mehr als 250 mg haben) und in ein 1.5 ml Reaktionsgefäß überführt. • 300 µl Puffer NT1 je 100 mg Gelstück zugeben (z.B. für 150 mg Gelstück 450 µl Puffer NT1). • 10 min bei 50 o C inkubieren (Gel wird aufgelöst). Alle 2 min kurz vortexen bzw. auf einem Schüttelheizblock inkubieren. • NucleoSpin Extract Spin Column in ein 2 ml „Collection“ – Reaktionsgefäß geben. • Die gesamte Probe in die NucleoSpin Extract Spin Column überführen und 1 min bei 12.000 rpm zentrifugieren. • Durchlauf entfernen und die Column wieder in das 2 ml „Collection“ – Reaktionsgefäß geben. 600 µl Puffer NT2 zugeben und 1 min bei 12.000 rpm zentrifugieren. • Durchlauf entfernen und die Column wieder in das 2 ml „Collection“ – Reaktionsgefäß geben. 200 µl Puffer NT3 zugeben und 2 min bei 12.000 rpm zentrifugieren. • NucleoSpin Extract Spin Column in ein neues 1.5 ml Reaktionsgefäß geben. 30 µl Puffer NE zugeben und 1 min bei Raumtemperatur inkubieren. 1 min bei 12.000 rpm zentrifugieren. 11
Seite 1 und 2: Molekularbiologische Übungen I Bei
Seite 9: Molekularbiologische Übungen I Bei

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