Determination of Bovine Kappa-Casein Genotype by PCR ... - Boku

Molekularbiologische Übungen I Beispiel Genotyp Version: 02.10.2008
7. TEIL
7.1. Waschen der hybridisierten Membran
Geräte:
Material:
Lösungen:
Schüttelwasserbad auf 60°C vorheizen
Taumelschüttler
Plastikwannen
200 ml Waschlösung I: 2 x SSC, 0.1 % SDS (am Vortag hergestellt)
200 ml Waschlösung II: 0.1 x SSC, 0.1 % SDS (am Vortag hergestellt)
Arbeitsanleitung:
20 x SSC: 3.0 M NaCl
0.3 M Tri-Natriumcitrat pH 7.0
Der 20 x SSC Puffer wird fallweise von den ÜbungsteilnehmerInnen hergestellt.
In diesem Fall ist die Einwaage ins Protokoll aufzunehmen.
20 % (w/v) SDS (Sodium/Natrium-dodecyl-sulfat) Lösung
• Hybridisierungslösung in Röhrchen zurückschütten und bis zur Wiederverwendung bei
-20°C einfrieren.
• Membran in Plastikwanne legen und 3 x in 50 ml Waschlösung I bei Raumtemperatur je 5
min am Kreisschüttler schwenken.
• Waschlösung I abschütten und 2 x in 50 ml vorgewärmter Waschlösung II bei 60°C je 15
min im Schüttelwasserbad waschen.
7.2. Immundetektion
Geräte:
Material:
Lösungen:
37°C Brutraum
Taumelschüttler
Folienschweißgerät
quadratische Petrischalen (12 x 12 cm)
Folien
Röntgenkassette
Röntgenfilm
10 % (w/v) steriles Blockierungsreagenz in Puffer 1 (Stammlösung)
Puffer 1: 200 ml 0.1 M Maleinsäure/NaOH pH 7.5
0.15 M NaCl
Der Puffer 1 wird fallweise von den ÜbungsteilnehmernInnen hergestellt.
In diesem Fall ist die Einwaage ins Protokoll aufzunehmen.
Puffer 2: 45 ml 1 % (v/v) Blockierungsreagenz in Puffer 1. Diese Lösung
wird aus der 10 % Stammlösung durch eine 1:10
Verdünnung hergestellt.
Blockierungslösung: Von den 45 ml werden 25 ml für die Blockierung des
Blottes verwendet und aus den restlichen 20 ml wir die
Antikörperlösung hergestellt.
Antikörperlösung: 20 ml Puffer 2 und 2 µl Anti-DIG-AP-Stammlösung
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