Determination of Bovine Kappa-Casein Genotype by PCR ... - Boku

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Molekularbiologische Übungen I Beispiel Genotyp Version: 02.10.2008 In diesem Beispiel soll mit Hilfe einer κ-CN spezifischen Sonde, die komplementär zum 277 bp Restriktionsfragment des κ-CN Genotyps A ist, hybridisiert werden. Diese Sonde detektiert auch das 409 bp Fragment des Genotyps B sowie das unverdaute <strong>PCR</strong>-Fragment. Wegen der hohen Sensitivität der Southern Blot Analyse werden auf das Agarosegel 1:100 Verdünnungen der unverdauten bzw. verdauten Proben geladen. Zusätzlich wird als Positivkontrolle eine vom Tutor zur Verfügung gestellte 1:100 Verdünnung einer verdauten heterozygoten Spermienprobe aufgetragen. Damit die DNA-Fragmentgröße auf dem Southern Blot bestimmt werden kann, wird ein DIG-markierter DNA-Längenstandard ebenfalls auf das Agarosegel geladen: 2.2 kb 1.7 kb 1.2 kb 1 kb 653 bp 517 bp 453 bp 394 bp 294 bp 234 bp , 220 bp 154 bp Gerät: Kreisschüttler Material: Agarosegel nach Gelelektrophorese ca. 15 x 10 cm große (= Gelgröße) positiv geladene Nylonmembran zehn 15 x 10 cm große (= Gelgröße) 3MM Filterpapiere schneiden pro Blot zwei 12 x 30 cm große 3MM Filterpapiere als Dochte Papierhandtücher (beim Tutor erhältlich) Frischhaltefolie Skalpell flache Pinzetten 10 ml Glaspipetten Plastikwanne 2 Glasplatten Gewicht (500 g, z.B. Pufferflaschen) Lösungen: 500 ml Denaturierungslösung: 0.5 N NaOH, 1.5 M NaCl (frisch zubereiten und Einwaage im Protokoll angeben) 14
Molekularbiologische Übungen I Beispiel Genotyp Version: 02.10.2008 500 ml 10 x SSPE Transferpuffer: Aus 20 x SSPE und sterilem dH 2 O herstellen 20 x SSPE: 3.6 M NaCl 0.2 M Na H 2 PO 4 /NaOH pH 7.4 20 mM EDTA Der 20 x SSPE Puffer wird fallweise von den ÜbungsteilnehmerInnen hergestellt. In diesem Fall ist die Einwaage ins Protokoll aufzunehmen. 4.2. Depurinierung und Denaturierung Kontrollierte Säurebehandlung depuriniert DNA, deren Doppelstränge sich in der folgenden Denaturierung lösen, sowie an den depurinierten Stellen brechen. Dadurch entstehen kleinere, leichter zu transferierende Fragmente. Depurinierung wird durchgeführt, wenn Fragmente größer als 10 kb übertragen werden sollen. In diesem Beispiel sind die <strong>PCR</strong> - Fragmente ca. 500 bp groß und daher entfällt der Depurinierungsschritt. • Das dokumentierte Gel wird 2 x 10 min in je 250 ml Denaturierungslösung am Kreisschüttler geschwenkt • danach mindestens 10 min in 200 ml 10 x SSPE bis zum Blottaufbau äquilibriert 4.3. Kapillar-Blot-Aufbau Beim Kapillarblot wird die Sogwirkung von Filterpapieren ausgenützt, um DNA-Fragmente auf eine Trägermembran zu transferieren. • Aus 3MM Filterpapieren einen doppelten Docht schneiden, der größer als das Gel ist und in die Pufferlösung eintauchen muß. • Diesen gleichmäßig mit Transferpuffer befeuchten und so auf die Glasplatte ohne Luftblasen plazieren, dass die Enden in die Pufferlösung tauchen. • Das Gel an der rechten unteren Ecke schräg abschneiden und auf den Docht gleiten lassen. Damit der Blottaufbau über Nacht nicht umfällt, werden jeweils zwei Gele zusammen bzw. das "nicht- getrennte" Gel geblottet. • Gel und Wanne mit Frischhaltefolie abdecken und mit dem Skalpell über dem Gel die Folie ausschneiden und entfernen (also ein gel-großes Fenster schneiden). • Die gelgroße trockene positiv geladene Nylonmembran ohne Berührung im Idealfall mit flachen Pinzetten auf das Gel legen. Durch Abscheiden einer Ecke (wie beim Gel) markieren. Weiters kann die Membran mit Bleistift am Rand an der von der DNA/Gel abgewandten Seite mit "back" bzw. Gruppenkürzel beschriftet werden. 15
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