Determination of Bovine Kappa-Casein Genotype by PCR ... - Boku

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Molekularbiologische Übungen I Beispiel Genotyp Version: 02.10.2008 Ethidiumbromid-Lösung (10 mg/ml) in dH 2 O (Achtung GIFTIG!) DNA-Längenstandard (50 ng/µl): 100 bp Leiter (GeneRuler 100 bp DNA Ladder Plus – Fa. MBI Fermentas, www.fermentas.com ): starke Bande = 500 Basenpaare (bp) Ladepuffer: 6 x Orange Loading Dye (10 mM Tris-HCl, pH 7.6; 0.15% orange G, 0.03% xylene cyanol FF, 60% glycerol, 60 mM EDTA; Fa. MBI Fermentas) Gießen des Agarosegeles (ein Gel für 6 Studenten – teilweise stehen die Agarosegele bereits zur Verfügung ) • Die Gelkassette wird an den Enden mit einem Klebeband abgedichtet, damit das aufgeschmolzene Agarosegel nicht ausfließen kann (vorher Gelkassette an den Rändern mit EtOH entfetten). • 1.5 g Agarose werden in einen 250 ml Kolben eingewogen • 100 ml 1 x TAE Puffer dazugeben • Der Kolben wird mit einer Frischhaltefolie, (kein Alu!) in die einige Löcher gestochen werden, verschlossen • Agarose wird in der Mikrowelle aufgeschmolzen bis keine Schlieren mehr sichtbar sind (Kolben mehrmals aus dem Ofen nehmen und leicht schütteln) • Nach dem Abkühlen der Lösung auf ca. 60-55 o C 7 µl Ethidiumbromid Lösung dazu geben und gut durchmischen Vorsicht Ethidiumbromid ist GIFTIG (starkes MUTAGEN)! Es muss unbedingt mit Handschuhen gearbeitet werden! • Anschließend die Lösung vorsichtig in entsprechende Gelkassette gießen (luftblasenfrei), der Kamm zur Formung der Geltaschen wird vorsichtig eingesetzt (20-Taschen-Kamm) • Gel bei Raumtemperatur erstarren lassen (Minimum 30 min) • Gele können auch mit Kollegen geteilt werden. Es ist vorteilhaft gleich das Gel das in Punkt 3.1. gebraucht wird mitzugießen, pro Student werden 10 Taschen benötigt. Gele halten im Kühlschrank in Frischhaltefolie einwickelt mehrere Tage. Auftragen der Proben und Elektrophorese: • Erstarrtes Agarosegel in die Elektrophorese-Apparatur so einlegen, dass die DNA in Richtung Anode (von Schwarz nach Rot) wandern kann. Mit 1 x TAE überschichten (Taschen müssen mit Flüssigkeit bedeckt sein) 8
Molekularbiologische Übungen I Beispiel Genotyp Version: 02.10.2008 • Aus der Verdünnungsreihe (Reaktionsgefäße 1-5) werden 20 µl Lösung in neue 1.5 ml Reaktionsgefäße gegeben. Aus Reaktionsgefäß 2: 2 x 20 µl nehmen! • 3 µl Ladepuffer dazugeben und in die Ladetaschen des Agarosegels überführen. Der Längenstandard enthält bereits Ladepuffer. • Die Proben werden folgendermaßen aufgetragen ( 6 Studenten verwenden ein Gel): Student 1 Student 2 Student 3 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Unverdünnt Verdünnung ~ 1:10 ! Verdünnung ~ 1:10 ! Verdünnung ~ 1:100 ! Negativ-Kontrolle Positiv-Kontrolle Längenstandard (500ng) Unverdünnt Verdünnung ~ 1:10 ! Verdünnung ~ 1:10 ! Verdünnung ~ 1:100 ! Negativ-Kontrolle Positiv-Kontrolle Längenstandard (500ng) Unverdünnt Verdünnung ~ 1:10 ! Verdünnung ~ 1:10 ! Verdünnung ~ 1:100 ! Negativ Kontrolle Positiv-Kontrolle Student 4 Student 5 Student 6 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Unverdünnt Verdünnung ~ 1:10 ! Verdünnung ~ 1:10 ! Verdünnung ~ 1:100 ! Negativ-Kontrolle Positiv-Kontrolle Längenstandard (500ng) Unverdünnt Verdünnung ~ 1:10 ! Verdünnung ~ 1:10 ! Verdünnung ~ 1:100 ! Negativ-Kontrolle Positiv-Kontrolle Längenstandard (500ng) Unverdünnt Verdünnung ~ 1:10 ! Verdünnung ~ 1:10 ! Verdünnung ~ 1:100 ! Negativ Kontrolle Positiv-Kontrolle Längenstandard in Basenpaaren (bp): 3000 bp 2000 bp 1200 bp 600 bp 500 bp 400 bp 300 bp 200 bp 100 bp • Die Elektrophorese bei 80 Volt bis ca. 45 min (60 Vhs) laufen lassen 9
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