Determination of Bovine Kappa-Casein Genotype by PCR ... - Boku

Molekularbiologische Übungen I Beispiel Genotyp Version: 02.10.2008
• Membran nochmals mit ca. 5 ml 10 x SSPE Puffer befeuchten.
• Drei in 10 x SSPE befeuchtete gel-große 3MM Filterpapiere vorsichtig auf die Membran
legen.
• Mit einer Glaspipette die eventuell unter der Membran liegenden Luftblasen ausstreichen.
• ca. 7 weitere trockene gel-große 3MM Filterpapiere auflegen
• Darauf eine ca. 5 cm hohe Schicht von ebenfalls gel-großen Papierhandtücher plazieren
und mit einer Glasplatte gleichmäßig (Wasserwaage!!) beschweren, auf der wiederum ein
ca. 0.5 kg schweres Gewicht (Pufferflasche) gestellt wird. Diese Flasche mit dem
Metallring gegen ein Umfallen sichern.
Die Gelvorbehandlung mit dem Blottaufbau sollte nicht länger als 2 Stunden benötigen.
Der DNA Transfer dauert mindestens 4 Stunden und am besten über Nacht.
4.4. DNA-Fixierung auf die Membran
• Den Blott abbauen und die DNA mit Hilfe des UV-Transilluminators auf der
Nylonmembran "Crosslinken". Dafür wird der Transilluminator mit Frischhaltefolie
abgedeckt und die Nylonmembran von jeder Seite 3 min mit 265 nm od. 302 nm
bestrahlen. (Bitte auf den Selbstschutz nicht vergessen und entweder den Raum
verlassen oder den UV-Schutz tragen).
Die so auf die Membran fixierten DNA Fragmente können trocken mehrere Monate gelagert
werden. Im vorliegenden Beispiel wird die Membran gleich hybridisiert.
5. TEIL
5.1. Hybridisierung
Geräte:
Material:
Lösungen:
Hybridisierungsofen auf 42°C vorheizen
Wasserbad auf 68°C vorheizen
10 ml Glaspipetten
Pipettierhilfe
Deckelschalen
ca. 8 ml Vorhybridisierungslösung (EasyHyb von Roche Diagnostics)
ca. 8 ml Haupthybridisierungslösung mit 5 - 25 ng/ml DIG-markierter κ-CN
Sonde
Bitte in Kolloquiumsunterlagen nachlesen, wie Sonden hergestellt werden können, und was
die Sensitivität bzw. Spezifität einer Sonde beeinflußt. Welche Markierungsmöglichkeiten gibt
es außer dem Digoxigeninsystem?
• Membran in gutschließende, rechteckige Plastik-Deckelschale legen und mit 8 ml
Vorhybridisierungslösung ca. 30 min bei 42°C vorhybridisieren lassen.
• In der Zwischenzeit Hybridisierunglösung ca. 10 min auf 68 °C aufheizen.
• Vorhybridisierungslösung mittels Trichter in Plastikflasche zurückschütten, da sie ca. 5 -
10 mal wiederverwendet werden kann.
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