Determination of Bovine Kappa-Casein Genotype by PCR ... - Boku

Molekularbiologische Übungen I Beispiel Genotyp Version: 02.10.2008
2. Zellpellet 3 mal mit je 1 ml 2 x PBS waschen, d.h. Pellet gut resuspendieren (mittels
1000 µl Kolbenhub-Pipette resuspendieren, nicht vortexen!) und wie in Punkt (1) bei
8.000 rpm abzentrifugieren, Überstand vorsichtig abheben und verwerfen.
3. Gewaschenes Pellet in 0.5 ml 1 x PBS gut resuspendieren (mittels 1000 µl
Kolbenhub-Pipette resuspendieren, nicht vortexen!) und vorsichtig mit 0.5 ml 25%
Percoll überschichten. 6 min bei 8.000 rpm zentrifugieren, Überstand vorsichtig
abheben und verwerfen.
4. Pellet noch einmal wie in Punkt 3. mit 1 x PBS (ohne Percoll!) waschen, bei 8.000
rpm 2 min zentrifugieren und Überstand gut absaugen (sehr vorsichtig, keine Zellen
abheben!).
5. Folgende Lösung in einem 1.5 ml Reaktionsgefäß herstellen:
39,0 µl dH 2 O
5,0 µl 10 x PCR-Puffer 1 x PCR-Puffer
2,0 µl DTE (0.5 M) (20 mM Endkonz.)
2,0 µl SDS (42.5 µM) (1.7 µM Endkoz.)
2,0 µl Proteinase K (5 mg/ml) (200 µg/ml Endkonz.)
50,0 µl Endvolumen
Pellet in 50 µl der Lösung mittels 200 µl Kolbenhub-Pipette resuspendieren
1 h bei 37 o C inkubieren (Heizblock mit Schütteln), Suspension soll ziemlich klar werden.
6. Proteinase K durch 10 min bei 95 o C inaktivieren (Heizblock); ausgefallenes Protein
abzentrifugieren (5 min, 13.000 rpm). Überstand in frische Eppendorfhütchen
überführen (DNA ist im Überstand enthalten), Pellet verwerfen.
7. DNA Verdünnungen für PCR - Ansatz wie unten angeführt in 0.3 ml Reaktionsgefäße
herstellen: Die einzelnen Verdünnungen jeweils gut mischen! Aus Ansatz 3 werden
nach dem Verdünnen/Mischen noch 2.8 µl entnommen und verworfen (um das
Volumen wieder auf 25 µl zu bringen). Alle Ansätze sollen auf Eis gelagert werden.
2.8 µl
2.8 µl
2 µl DNA
Pos.-Kontrolle
1
2
3
4
5
27.8 µl DNA
25 µl dH 2 O
25µl dH
25. µl dH 2 O 2 O
23µl dH 2 O
Unverd. ~1:10 ~1:100 dH 2 O (Neg.-Kontrolle) Pos.-Kontrolle
5