Determination of Bovine Kappa-Casein Genotype by PCR ... - Boku

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Molekularbiologische Übungen I Beispiel Genotyp Version: 02.10.2008 8. Probes 1 and 2 – A practical approach by B.D. Hames and S.J. Higgins, FB-BIO I 69649/1 bzw. /2 9. http://biology.neehow.org/wonderful/protocols/ind-prtc97.html#toc 10. http://www.nwfsc.noaa.gov/protocols.html 11. http://www.protocol-online.net/ 12. Datenbanken/NCBI: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query/static/help/helpdoc.html#Introduction 13. Literatursuche: Pubmed - http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?rid=helppubmed.section.pubmedhelp.Searching_PubM ed#pubmedhelp.A_basic_search 14. Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?rid=handbook.chapter.610 AND http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=pubmed&list_uids=15215342&dopt=Citation 2
Molekularbiologische Übungen I Beispiel Genotyp Version: 02.10.2008 Einführung Unter Caseinen versteht man eine Familie von Milchproteinen (alpha, beta, und kappa- Caseine), die in mehreren Allel-Varianten vorkommen. Kappa-Caseine (κ-CN) zum Beispiel existieren in verschiedenen allelischen Formen (z.B. Allele A, B, C, E), die einen besonderen Einfluß bei der Milch- und Käseproduktion haben. Daher werden bestimmte Genotypen für die Zucht bevorzugt. Im vorliegenden Beispiel wird eine Methode beschrieben, die eine rasche und zuverlässige Genotypisierung der Rinder κ-CN Allele erlaubt. Im Gegensatz zur direkten Analyse von Milchproteinen erlaubt diese Methode eine Genotypisierung direkt aus Spermazellen, Blut oder Gewebe. Ein 494 Basenpaare (bp) langes DNA-Fragment des Rinder κ-CN-Gens wird aus Stier-Spermazellen mittels Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) amplifiziert und einem Restriktionsverdau unterzogen. Die Identität des PCR-Produktes bzw. DNA-Fragmentes kann mit Hilfe einer Sequenz-Analyse und anschließendem Datenbankvergleich sowie mit einem Southern-Blot bestätigt werden. Im vorliegenden Beispiel soll A) mittels Restriktionsverdaus eine Identifizierung des κ-CN AA, AB oder BB Genotyps durchgeführt werden, B) die Identität der Restriktionsfragmente mittels Southern Blot bestimmt werden und C) der Unterschied zwischen AA, AB oder BB Genotypen auf einem Sequenzanalyse-Chromatogramm festgestellt sowie D) eine Datenbanksuche durchgeführt werden. Aufgund einer Punktmutation in der DNA-Sequenz an Position 274 des PCR Produktes in Allel A entsteht eine zusätzliche Hinf I Schnittstelle, die in Allel B nicht vorkommt. Diese Schnittstelle kann daher verwendet werden um zwischen den κ-CN Genotypen A und B zu unterscheiden. Nach erfolgtem Hinf I Verdau erhält man je nach Genotyp unterschiedlich lange Fragmente bzw. eine unterschiedliche Anzahl von Fragmenten. JK500 JK302 * 277 bp 85 bp 132 bp Hinf I (A) Hinf I (A, B) Schematische Darstellung des PCR Produktes (494 bp) von Allel A und B (* = Punktmutation) amplifiziert mit Primer JK500 und JK302. Der grüne Balken markiert die Sonde, die bei der Southern Blot Analyse verwendet wird. 3
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