Determination of Bovine Kappa-Casein Genotype by PCR ... - Boku

Molekularbiologische Übungen I Beispiel Genotyp Version: 02.10.2008
1.2. Durchführung der PCR
Da es sich bei der PCR um eine sehr starke Anreicherung bestimmter DNA Stücke handelt
(von einem Molekül können bis zu 10 8 Moleküle amplifiziert werden), kommt es häufig zu
Kontaminationen. Daher ist es bei diesem Schritt besonders wichtig, sauber und genau zu
arbeiten.
Gerät:
Material:
Lösungen:
Thermocycler (für 0.3 ml Reaktionsgefäße)
Reaktionsgefäße (0.3 ml)
Kolbenhub-Pipetten (200 µl, 20 µl)
gelbe Pipettenspitzen
dH 2 O (sterile deionized water)
10 x PCR-Puffer: 100 mM Tris, pH 8.8, 500 mM KCl, 15 mM MgCl 2 , 1% Triton
10 mM dNTP Mix (10 mM of each dATP, dCTP, dGTP, dTTP)
Primer JK500 (20 µM bzw. 20 pmol/µl); JK302 (20 µM)
Taq DNA-Polymerase (~5 U/µl)
Positiv-Kontrolle: gereinigtes kappa-Casein 494 bp DNA-Fragment
(~0.25pg/µl)
Pro Person werden 5 Ansätze á 25 µl DNA (entsprechende Verdünnung) + 25 µl PCR-
Prämix gemacht.
PCR-Prämix (Reihenfolge einhalten):
103,0 µl dH 2 O
30,0 µl 10 x PCR Puffer
3,0 µl dNTP Mix (je 10mM)
6,0 µl Primer JK 500 (20 pmol/µl)
6,0 µl Primer JK 302 (20 pmol/µl)
vortexen
2,0 µl Taq Polymerase (~5 U/µl)
150,0 µl Gesamt (gut mischen, nicht vortexen)
PCR- Ansätze:
• Zu den Eppendorfhütchen 1-5, in denen sich bereits 25 µl DNA Verdünnungen (bzw. nur
dH 2 O im Ansatz 4) befinden, werden 25 µl PCR-Prämix gegeben. PCR-Prämix zuerst zu
1-4 dazugeben und zum Schluß zu 5, um eine Kontamination mit der Positiv-Kontrolle zu
vermeiden.
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