Determination of Bovine Kappa-Casein Genotype by PCR ... - Boku

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Molekularbiologische Übungen I Beispiel Genotyp Version: 02.10.2008 DURCHFÜHRUNG 1. TEIL 1.1. Reinigung von genomischer DNA aus Rindersperma Da für die PCR nur wenig Ziel-DNA eingesetzt werden muß, erfolgt nur eine rohe Extraktion der genomischen DNA aus Stiersperma. Die intakten Zellen werden mittels Percoll- Dichtezentrifugation isoliert und mittels Detergens (SDS), einer reduzierenden Substanz (DTE) sowie Proteinase K aufgeschlossen. Die DNA liegt nach dieser Behandlung im Überstand vor und kann ohne weitere Reinigungsschritte für die anschließende PCR verwendet werden. Gerät: Material: Lösungen: Tischzentrifuge Heizblock 1 Röhrchen mit Stier-Spermazellen (ca.10 6 –10 7 Zellen, beim Tutor erhältlich!) (Nach dem Erhalt der Probe soll sofort mit Schritt 1 begonnen werden!) Reaktionsgefäße: 1.5 ml und 0.3 ml Schere, Skalpell Kolbenhub-Pipetten (1000 µl, 200 µl, 20 µl) Blaue und gelbe Pipettenspitzen dH 2 O (sterile deionized water) 10 x PBS: für 1 l: 80 g NaCl, 2 g KCl, 14.4 g Na 2 HPO 4 , 2.4 g K 2 HPO 4 2 x PBS durch Verdünnen mit dH 2 O aus 10 x PBS herstellen (ergibt ~ pH 7.3) 1 x PBS durch Verdünnen mit dH 2 O aus 10 x PBS herstellen, pH mit HCl auf 7.4 einstellen 25% Percoll in 1 x PBS 10 x PCR-Puffer: 100 mM Tris, pH 8.8, 500 mM KCl, 15 mM MgCl 2 , 1% Triton 0.5 M DTE (Dithioerythritol, Antioxidants) in DMSO (dimethyl sulfoxide) 42.5 µM SDS (Sodium Dodecyl Sulfate, anionisches Detergens) in dH 2 O Proteinase K (5 mg/ml) in dH 2 O 1. Röhrchen mit Stier-Spermazellen an einem Ende (auf der Seite mit dem Glaswollstopfen) aufschneiden und über ein 1.5 ml Reaktionsgefäß halten. Danach vorsichtig das zweite Ende aufschneiden und die zähe Flüssigkeit in das Reaktionsgefäß tropfen lassen. (Es sollten ca. 100-200 µl Suspension im Reaktionsgefäß sein.) Zellsuspension mit 0.5 ml 2 x PBS gut durchmischen (mittels 1000 µl Kolbenhub-Pipette resuspendieren, nicht vortexen!) und 2 min bei 8.000 rpm abzentrifugieren. (Tischzentrifuge verwenden). Den Überstand vorsichtig abheben (zuerst mit 1000 µl dann mit 200 µl Kolbenhub-Pipette) und verwerfen. 4
Molekularbiologische Übungen I Beispiel Genotyp Version: 02.10.2008 2. Zellpellet 3 mal mit je 1 ml 2 x PBS waschen, d.h. Pellet gut resuspendieren (mittels 1000 µl Kolbenhub-Pipette resuspendieren, nicht vortexen!) und wie in Punkt (1) bei 8.000 rpm abzentrifugieren, Überstand vorsichtig abheben und verwerfen. 3. Gewaschenes Pellet in 0.5 ml 1 x PBS gut resuspendieren (mittels 1000 µl Kolbenhub-Pipette resuspendieren, nicht vortexen!) und vorsichtig mit 0.5 ml 25% Percoll überschichten. 6 min bei 8.000 rpm zentrifugieren, Überstand vorsichtig abheben und verwerfen. 4. Pellet noch einmal wie in Punkt 3. mit 1 x PBS (ohne Percoll!) waschen, bei 8.000 rpm 2 min zentrifugieren und Überstand gut absaugen (sehr vorsichtig, keine Zellen abheben!). 5. Folgende Lösung in einem 1.5 ml Reaktionsgefäß herstellen: 39,0 µl dH 2 O 5,0 µl 10 x PCR-Puffer 1 x PCR-Puffer 2,0 µl DTE (0.5 M) (20 mM Endkonz.) 2,0 µl SDS (42.5 µM) (1.7 µM Endkoz.) 2,0 µl Proteinase K (5 mg/ml) (200 µg/ml Endkonz.) 50,0 µl Endvolumen Pellet in 50 µl der Lösung mittels 200 µl Kolbenhub-Pipette resuspendieren 1 h bei 37 o C inkubieren (Heizblock mit Schütteln), Suspension soll ziemlich klar werden. 6. Proteinase K durch 10 min bei 95 o C inaktivieren (Heizblock); ausgefallenes Protein abzentrifugieren (5 min, 13.000 rpm). Überstand in frische Eppendorfhütchen überführen (DNA ist im Überstand enthalten), Pellet verwerfen. 7. DNA Verdünnungen für PCR - Ansatz wie unten angeführt in 0.3 ml Reaktionsgefäße herstellen: Die einzelnen Verdünnungen jeweils gut mischen! Aus Ansatz 3 werden nach dem Verdünnen/Mischen noch 2.8 µl entnommen und verworfen (um das Volumen wieder auf 25 µl zu bringen). Alle Ansätze sollen auf Eis gelagert werden. 2.8 µl 2.8 µl 2 µl DNA Pos.-Kontrolle 1 2 3 4 5 27.8 µl DNA 25 µl dH 2 O 25µl dH 25. µl dH 2 O 2 O 23µl dH 2 O Unverd. ~1:10 ~1:100 dH 2 O (Neg.-Kontrolle) Pos.-Kontrolle 5
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