Determination of Bovine Kappa-Casein Genotype by PCR ... - Boku

Molekularbiologische Übungen I Beispiel Genotyp Version: 02.10.2008
Arbeitsanleitung:
Puffer 3: 20 ml 0.1 M Tris/HCl pH 9.5
0.1 M NaCl
Der Puffer 3 wird fallweise von den ÜbungsteilnehmernInnen hergestellt.
In diesem Fall ist die Einwaage ins Protokoll aufzunehmen.
200 µl Chemieluminiszenzsubstrat: CSPD "ready-to-use"
Entwickler
Fixierer
• Nach dem letzten Waschschritt Membran ca. 2 min in ca. 50 ml Puffer 1 am Kreisschüttler
schwenken. Darauf achten, dass die Membranen nicht übereinander zu liegen kommen.
• Puffer 1 abschütten und 30 min mit 25 ml Puffer 2 unter Schwenken blockieren, danach
wird die Blockierungslösung weggeschüttet.
• Von der Oberfläche der Anti-DIG-AP-Konjugat-Stammlösung 2 µl zu 20 ml Puffer 2 pipettieren
(1:10.000).
• Membran 30 min in der Anti-DIG-AP-Lösung am Kreisschüttler schwenken. Darauf
achten, dass die Membranen nicht übereinander zu liegen kommen.
• Membran in frische/gut gewaschene Plastikpetrischale mit 2 x 50 ml Puffer 1 je 15 min
schwenken. Darauf achten, dass die Membranen nicht übereinander zu liegen kommen.
• Membran für 2 min in 20 ml Puffer 3 äquilibrieren.
• Das Chemieluminiszenzsubstrat (ca. 200 µl CSPD „ready to use“) auf eine
Einschweißfolie tröpfeln. Die Membran möglichst ohne Luftblasen (DNA-Seite zum
Substrat zugewandt – i.e. nach unten) drauf legen, mit einer zweiten Folie abdecken und
das Substrat gleichmäßig verteilen. Das gelingt am besten mit einem Papiertuch, welches
mit sanften Druck auf der Einschweißfolie kreisförmig bewegt wird.
• Nach 5 min Inkubation überschüssige Flüssigkeit kräftig ausstreichen, die Ränder der Folie
verschweißen und 1 – 1.5 Std. bei 37°C (im Brutraum) gleich mit einem Röntgenfilm
exponieren. Die Dauer der Exposition ist von der Bandenintensität des Agarosegels und von
der Bloteffizienz abhängig. Die Betreuerin und TutorInnen stehen Ihnen zur Verfügung, die
Expositionszeit abzuschätzen.
• Der Röntgenfilm bzw. die Röntgenfilmkassette darf nur im dunkeln Raum mit rotem
Schutzlicht geöffnet und manipuliert werden.
• Für die Entwicklung des Films wird der Entwickler (schwarze Wanne), Wasser (weiße
Wanne) und Fixierer (rote Wanne) aus den Vorratsgefäßen in die jeweils dafür
vorgesehenen Wannen fingerhoch geschüttet. Wenn der Film aus der Kassette genommen
wird, darf nur noch das Sicherheitslicht (Rotlicht) den Dunkelraum beleuchten.
• Film zuerst in den Entwickler legen, 1-3 min warten, danach mit einer Pinzette ins Wasser
transferieren (ca. 30 sec) und als letztes in den Fixierer legen. Nach ca. 30 sec ist der Film
fixiert, und das Licht kann wieder angeschaltet bzw. der Raum geöffnet werden.
• Den Film wieder mit Wasser spülen und abtropfen lassen. Da die Gelatineoberfläche
empfindlich ist, bitte den Film nur Lufttrocknen lassen. Erst wenn er vollständig trocken ist,
kann er beschriftet und transportiert werden.
• Die verwendeten Lösungen wieder in die Vorratsgefäße zurückschütten, da diese mehrmals
verwendet werden können. Ein Austausch ist erst notwendig, wenn der Entwickler eine
braun-graue Farbe angenommen hat.
21