Untersuchungen zur Anwendbarkeit und Validität von In-vitro ...

II Ergebnisse und Diskussion 107
Mikrotiterplatten eine Spaltbreite von ±10/±20 nm (Anregung/Emission) eingestellt
werden, wobei für die weißen Mikrotiterplatten eine Spaltbreite von ±5/±5 nm
ausreichte (Tab. 11). Bei doppelter Spaltbreite des Emissionsfilters (von ±10 nm auf
±20 nm) resultierte für die schwarzen Mikrotiterplatten ungefähr eine Zunahme der
Fluoreszenzintensität um den Faktor 5-6 (Tab. 11). Da jedoch die Fluoreszenzintensität
des Hintergrundes („Hintergrund-Rauschen“) um den gleichen Faktor
zunimmt, bewirkt eine Vergrößerung der Spaltbreite in der Regel zwar eine Erhöhung
der Fluoreszenzintensität aber keine Verbesserung des Signal-Rausch-Verhältnisses
(Tab. 11). Die Hintergrundfluoreszenz wird durch eine so genannte Hintergrundkontrolle
bestimmt, deren Zusammensetzung (Puffer, Enzym, NADPH, Substrat) der
einer Kontrollinkubation (100 %ige Enzymaktivität) entspricht, wobei keine
enzymatische Umsetzung erfolgt.
Tab. 11 Fluoreszenzintensitäten einer CYP1A2-Kontrollinkubation (Substrat: 3-Cyano-7ethoxycumarin;
100 %ige Enzymaktivität) und einer Hintergrundkontrolle (siehe Text) bei
unterschiedlichen Filterspaltbreiten für die Anregung und Emission zur Bestimmung des Signal-
Rausch-Verhältnisses der verwendeten Mikrotiterplatten. Die Anregungs- und Emissionswellenlänge
betrug 409 nm und 460 nm.
Filterspaltbreite (±) für
Anregung/Emission
Fluoreszenzintensität
weiße Mikrotiterplatte schwarze Mikrotiterplatte
5 nm/5 nm
5 nm/10 nm
10 nm/10 nm
10 nm/20 nm
Kontrolle 332 >999 75 428
Hintergrundkontrolle 4 18 31 168
Signal-Rausch-Verhältnis 83:1 - 2,4:1 2,5:1
Für die weißen Mikrotiterplatten resultierte ein Verhältnis der Fluoreszenzintensitäten
der Kontrollinkubation (CYP1A2/CEC) zur Hintergrundfluoreszenz von 83 zu 1,
während sich für die schwarzen Platten ein sehr geringes Verhältnis von 2,5 zu 1
ergab (Tab. 11). Dieses Ergebnis bestätigte die Angaben des Herstellers der
verwendeten Mikrotiterplatten (Nunc, Langenselbold, Deutschland). Im Gegensatz zu
schwarzen Mikrotiterplatten verstärken weiße Platten die Fluoreszenzsignale und
zeigen eine äußerst geringe Hintergrundfluoreszenz (www.nunc.de).