Untersuchungen zur Anwendbarkeit und Validität von In-vitro ...
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V MATERIAL UND METHODEN 199<br />
Zeit [min] Fließmittel (% B) Flussrate [ml/min]<br />
0,00 25 1,0<br />
2,00 25 1,0<br />
5,00 40 1,0<br />
5,01 100 1,0<br />
7,00 100 1,0<br />
Das Massenspektrometer wurde 2 min nach der Probeninjektion aktiviert <strong>und</strong> der<br />
Metabolit 4-Hydroxybupropion (m/z 256) sowie der interne Standard Propranolol (m/z<br />
260) wurden als [M+H] + -Ionen mittels ESI im positiven SIM-Modus quantifiziert<br />
(Fragmentorspannung 100 mV). Als Verneblungs- <strong>und</strong> Trocknungsgas wurde<br />
Stickstoff verwendet (Druck 50 psi; Temperatur 300 °C, Flussrate 12 L/min). Die<br />
Spannung der Kapillare betrug -3500 V.<br />
CYP2C8-Assay (6α-Hydroxylierung <strong>von</strong> Paclitaxel)<br />
Der <strong>In</strong>hibitor, gelöst in Methanol 80 % (V/V) oder DMSO, wurde mit rekombinantem<br />
CYP2C8 (12 pmol/ml), Paclitaxel (10 µM) <strong>und</strong> NADPH (1 mM) in einem 100 mM<br />
Kaliumphosphatpuffer (3 mM MgCl2; pH 7,4) bei 37 °C in einem Gesamtvolumen <strong>von</strong><br />
300 µl inkubiert <strong>und</strong> nach 30 min mit 150 µl eiskaltem Methanol, der den internen<br />
Standard Reserpin enthielt, abgestoppt. Nach Zentrifugation bei 10.000·g wurden<br />
jeweils etwa 400 µl des klaren Überstands in ein HPLC-Vial überführt <strong>und</strong> mittels<br />
LC/ESI-MS mit Online-Festphasenextraktion analysiert.<br />
50 µl des <strong>In</strong>kubationsansatzes wurde auf die Extraktionssäule (Zorbax Eclipse XDB-<br />
C18; 12,5 x 4,6 mm; 5 µm) injiziert. Der Ladepuffer bestand aus 0,1 %<br />
Trifluoressigsäure/10 mM Ammoniumacetat in Wasser (A) <strong>und</strong> Methanol (B). Die<br />
Zusammensetzung des Ladepuffers war während der Extraktionsphase (0-2 min)<br />
90 % A <strong>und</strong> 10 % B, wobei die Flussrate 3 ml/min betrug. Das Schaltventil wurde<br />
nach 2 min umgeschaltet, so dass die Analyten im Backflush-Modus <strong>von</strong> der<br />
Extraktionssäule auf die analytische Säule (Zorbax Bonus-RP; 50 x 2,1 mm; 3,5 µm)<br />
gespült wurden. Die Zusammensetzung der mobilen Phase für die analytische<br />
Trennung war 10 mM Ammoniumacetat <strong>und</strong> 0,1 % Ameisensäure in Wasser (A) <strong>und</strong><br />
0,1 % Ameisensäure in Acetonitril (B). Der Fließmittelgradient sowie die Flussrate<br />
der analytischen Trennung sind unten angegeben. Die Temperatur für die<br />
analytische Säule <strong>und</strong> Extraktionssäule betrug 30 °C.