Untersuchungen zur Anwendbarkeit und Validität von In-vitro ...

V MATERIAL UND METHODEN 201
Zeit [min] Fließmittel (% B) Flussrate [ml/min]
0,00 35 0,8
2,00 35 0,8
5,00 70 0,8
5,01 100 1,0
7,00 100 1,0
Das Massenspektrometer wurde 2 min nach der Probeninjektion aktiviert und der
Metabolit 4-Hydroxytolbutamid (m/z 287) sowie der interne Standard Chlorpropamid
(m/z 277) wurden als [M+H] + -Ionen mittels ESI im positiven SIM-Modus quantifiziert
(Fragmentorspannung 100 mV). Als Verneblungs- und Trocknungsgas wurde
Stickstoff verwendet (Druck 50 psi; Temperatur 300 °C, Flussrate 12 L/min). Die
Spannung der Kapillare betrug -3500 V.
CYP2C19-Assay (N-Demethylierung von Imipramin)
Der Inhibitor, gelöst in Methanol 80 % (V/V) oder DMSO, wurde mit rekombinantem
CYP2C19 (6 pmol/ml), Imipramin (2,5 µM) und NADPH (1 mM) in einem 100 mM
Kaliumphosphatpuffer (3 mM MgCl2; pH 7,4) bei 37 °C in einem Gesamtvolumen von
300 µl inkubiert und nach 30 min mit 150 µl eiskaltem Methanol, der den internen
Standard Maprotilin enthielt, abgestoppt. Nach Zentrifugation bei 10.000·g wurden
jeweils etwa 400 µl des klaren Überstands in ein HPLC-Vial überführt und mittels
LC/ESI-MS mit Online-Festphasenextraktion analysiert.
50 µl des Inkubationsansatzes wurde auf die Extraktionssäule (Zorbax Eclipse XDB-
C18; 12,5 x 4,6 mm; 5 µm) injiziert. Der Ladepuffer bestand aus 0,1 %
Trifluoressigsäure/10 mM Ammoniumacetat in Wasser (A) und Methanol (B). Die
Zusammensetzung des Ladepuffers war während der Extraktionsphase (0-2 min)
90 % A und 10 % B, wobei die Flussrate 3 ml/min betrug. Das Schaltventil wurde
nach 2 min umgeschaltet, so dass die Analyten im Backflush-Modus von der
Extraktionssäule auf die analytische Säule (Zorbax Bonus-RP; 50 x 2,1 mm; 3,5 µm)
gespült wurden. Die Zusammensetzung der mobilen Phase für die analytische
Trennung war 10 mM Ammoniumacetat und 0,1 % Ameisensäure in Wasser (A) und
0,1 % Ameisensäure in Acetonitril (B). Der Fließmittelgradient sowie die Flussrate
der analytischen Trennung sind unten angegeben. Die Temperatur für die
analytische Säule und Extraktionssäule betrug 30 °C.