Untersuchungen zur Anwendbarkeit und Validität von In-vitro ...
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II Ergebnisse <strong>und</strong> Diskussion 53<br />
LC/ESI-MS mit Online Festphasenextraktion<br />
Während die enzymkinetischen Parameter der Substrate ein wichtiger Aspekt für die<br />
Auswahl der Substanzen sind, müssen die aus den Substraten enzymatisch<br />
gebildeten Produkte (Metabolite) je nach Analysenverfahren weitere besondere<br />
Kriterien erfüllen. Da in dieser Arbeit die Metabolite selektiv mit Hilfe <strong>von</strong> LC/ESI-MS<br />
nach Online-Festphasenextraktion in Anwesenheit der Pflanzenmatrix bestimmt<br />
werden sollen, müssen die verwendeten Metabolite folgende Eigenschaften<br />
aufweisen.<br />
Für eine ausreichende <strong>und</strong> selektive massenspektrometrische Detektion in<br />
Anwesenheit einer Pflanzenmatrix spielt eine starke Retention der Metabolite an RP-<br />
Material eine große Rolle. Durch die richtige Wahl des Fließmittels (organisches<br />
Lösungsmittel, pH-Wert, Additiva etc.) <strong>und</strong> Säulenmaterials (C8, C18 endcapped<br />
etc.) kann die Retention der Analyten in einem gewissen Rahmen verstärkt werden.<br />
Dennoch sollten die Metabolite keine zu polaren Strukturen aufweisen, damit diese<br />
an der Extraktionssäule eine vollständige Retention bei einer Methanolkonzentration<br />
<strong>von</strong> mindestens 5 % zeigen. Umso stärker das Retentionsverhalten der Analyten an<br />
der Extraktionssäule ist, desto höher kann der organische Lösungsmittelanteil des<br />
Ladepuffers gewählt werden. Durch einen hohen organischen Lösungsmittelanteil<br />
des Ladepuffers kann ein großer Teil an unerwünschter polarer Probenmatrix (Salze,<br />
Polyphenole, Zucker etc.) ausgewaschen werden, so dass eine relativ saubere<br />
Probe für die LC/ESI-MS-Analytik <strong>zur</strong> Verfügung steht.<br />
Des Weiteren sorgt eine mittlere bis hohe Retention der Metaboliten an RP-<br />
Materialien dafür, dass die Metaboliten <strong>von</strong> den an der Extraktionssäule<br />
festgehaltenen Bestandteilen der Probenmatrix (z. B. <strong>In</strong>haltsstoffe <strong>von</strong><br />
Pflanzenextrakten) chromatographisch auf der analytischen Säule abgetrennt<br />
werden kann. Aufgr<strong>und</strong> der höheren Elutionskraft des analytischen Fließmittels im<br />
Vergleich zum Ladepuffer eluieren in den ersten 2 Minuten des analytischen HPLC-<br />
Laufes viele polare bis mittelpolare Substanzen der Probenmatrix, die durch den<br />
Ladepuffer nicht <strong>von</strong> der Extraktionssäule heruntergewaschen <strong>und</strong> an der<br />
Extraktionssäule <strong>zur</strong>ückgehalten werden. Damit die Ionisierung der Analyten nicht<br />
beeinträchtigt wird, sollte die Elution der Analyten erst nach 2 Minuten erfolgen.<br />
Für eine empfindliche massenspektrometrische Detektion mittels Elektrospray-<br />
Ionisierung sollten die enzymatisch gebildeten Produkte, wie unter II.1.1 ausführlich
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