PDF Download - Laborwelt

B L I T Z L I C H T
Automation
Ultraschnelle DNA-Amplifikation
mit Rapid-PCR
Dr. Hanno Hermann, Claus Knippschild, Analytik Jena AG
Die Ansprüche an die Geschwindigkeit, Effizienz und Qualität der Ergebnisse der Polymerase-Kettenreaktion
(PCR) sind mit der steigenden Anzahl und Vielfalt der Anwendungen dieser
Schlüsseltechnologie größer geworden. Die hier vorgestellte, neue Rapid-Cycle-PCR-Technologie
ermöglicht jetzt substantielle Fortschritte bei der Einlösung der gestiegenen Anforderungen
an die PCR. Neben der Erläuterung der technischen Grundlagen werden hier die
Eigenschaften des „SpeedCycler“-Systems an Anwendungsbeispielen erläutert.
Key Words: PCR, Rapid-PCR, Spezifität, ultradünne Mikrotiterplatten, Speedcycler
Seit der Entwicklung der PCR-Methode 1985
durch Kary Mullis 1-2 und seine Mitarbeiter haben
stetige Innovationen dazu beigetragen,
daß aus der PCR eine Schlüsseltechnologie
für die biologische Forschung und Routine-
Diagnostik geworden ist. Meilensteine dabei
waren etwa der Einsatz hitzestabiler DNA-
Polymerasen wie der Taq-DNA-Polymerase 3
sowie die Entwicklung der Thermocycler, die
eine automatisierte und parallele Durchführung
der Polymerase-Kettenreaktion mit einer
Vielzahl von Proben erst ermöglichten.
Von Ende der achtziger Jahre an wurden
kommerzielle Thermocycler entwickelt, die
mit Standard-Mikrozentrifugen-Tubes als
Probenbehälter und temperierten Metallblökken
zur Aufnahmen der Tubes arbeiten. Unter
den für das Aufheizen und Kühlen des
Blocks genutzten Prinzipien (Wärmelampen,
die relativ geringen effektiven Heiz- und
Kühlraten von 1-2 °C/s innerhalb der Probe,
die durch großvolumige Metallblöcke und
die große Wandstärke der Plastik-Probengefäße
(200-300 µm) bedingt sind. Daraus resultieren
Zykluszeiten von 3 bis 8 Minuten
und ein Gesamtzeit-Bedarf von zwei bis drei
Stunden für übliche PCR-Experimente.
Da die Ansteuerung der Temperaturzyklen
eine zentrale Rolle in der Polymerase-Ketten-
Reaktion spielt, wurde schon bald nach Alternativen
mit einer schnelleren Prozeßführung
gesucht. Eine Reihe von Reaktoren und
Technologien für schnelle Temperaturführung
kleiner Probenvolumina wurde so getestet
4-5 . Wittwer (siehe LABORWELT 2/2000)
entwickelte ab 1989 eine sehr schnelle Thermocycler-Technologie
auf Grundlage der
Temperierung mit heißer oder kühler Luft
Abb. 1: Der Speedcycler als „personal thermocycler“ mit 36-well-Mikrotiterplatte
elektr. Widerstandsheizung, Wasserkühlung,
etc.) hat sich bei den heute geläufigen Thermocyclern
fast ausnahmslos die Verwendung
von Peltierelementen durchgesetzt, die eine
robuste und kompakte Bauweise der Geräte
ermöglichen. Ein weiterer Vorteil dieser PCR-
Geräte ist die Verwendbarkeit von Mikrotiterplatten
nach den SBS-Normen 96 oder 384.
Damit ist der Einsatz der üblichen manuellen
Pipettiertechnik und der Standard-Automatisierungslösungen
für ein PCR-set up
möglich. Als Nachteil erwiesen sich dagegen
und der Verwendung von Glaskapillaren als
Probengefäßen 6 . Die experimentellen Erfahrungen
mit diesem kommerziell verfügbaren
System führten zur Definition der ultraschnellen
PCR als „Rapid cycle PCR“ – 30
Amplifikations-Zyklen in weniger als 30 Minuten
7 . Auf Grund sehr hoher Heiz- und
Kühlraten (> 8 °C/s) dauert ein einzelner
Temperaturzyklus etwa 20 Sekunden, damit
sind PCR-Experimente mit einer Dauer von
rund 15 Minuten möglich. Neben der Verkürzung
der PCR-Experimente eröffnete die Ra-
pid-cycle-PCR als weiteren Vorteil eine verbesserte
Qualität der PCR-Produkte. Die
durch die schnelleren Kühlraten und kurze
Annealingzeiten erfolgte präzisere Primer–
Template–Paarung bedingt hierbei eine höhere
Spezifität der Amplikons. Diese spezielle
Rapid-PCR-Technologie weist aber auch
einige Nachteile auf. Das Befüllen der einzelnen
Kapillaren erwies sich als relativ kompliziert,
die Standard-Pipettiertechnik als mit
dem System nicht kompatibel. Dies limitiert
den Probendurchsatz – eine Automatisierung
der PCR mit marktüblichen Workstations ist
nicht möglich. Die relativ große Oberfläche
der Glas-Kapillaren kann zudem die Komponenten
des PCR-Ansatzes adsorbieren. Es
kann also etwa zum Verlust der Enzym-Aktivität
oder zur irreversiblen Bindung von
DNA an die Glasoberfläche kommen. Um
diese Effekte zu vermeiden, müssen dem Master-Mix
zusätzlich ein Carrier-Protein (BSA)
zugefügt und die Enzymkonzentration optimiert
werden.
Peltier-Rapid-PCR
in ultradünnen Mikrotiterplatten
Um neue Applikationen und experimentelle
Wege zu ermöglichen, mußte es das Entwicklungsziel
einer neuartigen PCR-Technologie
sein, die positiven Eigenschaften der beiden
beschriebenen Thermocycler-Klassen zu verknüpfen
und die Nachteile auszuschalten –
also Schnelligkeit und Automation zu vereinen.
Das neue SpeedCycler ® -System erreicht
dies durch Kombination eines mit Peltier-Elementen
betriebenen Block-Thermocyclers
und einer speziellen ultradünnen Mikrotiterplatte
aus Plastikmaterial, deren Probenbehälter
entsprechend der SBS-Norm angeordnet
sind (Abb. 1). Damit bietet das System
eine Kombination von hoher Geschwindigkeit,
Möglichkeit der Nutzung der in allen
Laboren vorhandenen Pipettier- und Automatisierungstechniken
und ein gemeinsames
Prozessieren der Proben in Gefäßen aus biokompatiblen
Kunststoffen.
Die hohe Geschwindigkeit des Systems
wird durch mehrere technische Merkmale
erreicht. Der Rapid-Thermocycler zeichnet
sich aus durch:
– Die Verwendung von modernen Hochleistungs-Peltierelementen,
die einen
– kleinvolumigen Metallblock mit geringer
thermischer Kapazität temperieren.
Die in den Metallblock eingesetzte Mikrotiterplatte
zeichnet sich aus durch:
– sehr dünne Wände der Probengefäße
(10fach dünner als Standard-Gefäße) und
– eine hohe Flexibilität der Wandungen während
der PCR.
Schnelle Regelalgorithmen steuern Peltierelemente
an, die den Rapid-Block fast verzögerungsfrei
temperieren. Die für das PCR-Experiment
entscheidende Übertragung der
Energie in die Probenlösung erfolgt durch
die dünne Folienwandung sehr effektiv.
LABORWELT 5. Jahrgang | Nr. 3/2004 | 11