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B L I T Z L I C H T
wurden verschiedene Sequenzvarianten der
Sonde mit angepaßten Primern an klinischen
Proben importierter Malaria tropica aus der
Routinediagnostik des Bernhard-Nocht-Instituts
für Tropenmedizin (Prof. Tannich, Hamburg)
getestet und sequenziert, um ein möglichst
klares Bild der auftretenden Sequenzvariationen
in der K76T-Zielregion zu erhalten.
Aus diesen Daten wurde dann ein routinetaugliches
PCR-System zum differentiellen
Nachweis aller Allele der K76T-Zielregion
vorgeschlagen.
Funktionalität
des real-time PCR-Systems
Mit dem ausgewählten PCR-System ließen
sich alle bisher in klinischen Blutproben 10 gefundenen
Allele der CQR- und CQS-Stämme
von P. falciparum sicher unterscheiden (Abb.
3) und in unbekannten Proben selbst in Doppelinfektionen
mit anderen Plasmodien-Arten
wieder erkennen. Im Rahmen dieser Studie
konnte bislang noch keine Probe mit dem
CQS-Allel „1S“, entsprechend Nr. 2 in Abbildung
2 und 3, gefunden werden. Daher dient
das ursprünglich zu Kontrollzwecken synthetisch
hergestellte PCR-Produkt bis auf weiteres
als Positivkontrolle in jedem PCR-Lauf.
Zur Bewertung der Ergebnisse einer CQreal-time-PCR
und einer möglicherweise daraus
abzuleitenden Therapie zählt nur, ob sich
nach der PCR eine Schmelzkurve mit einem
Schmelzpunkt in der Nachbarschaft (± 1° C)
einer der beiden CQR-Schmelzkurventypen
(1R, 2R) zeigt. Dies ist zur Bewertung der gelegentlich
auftretenden Doppelinfektionen mit
mehr als einem CQ-Allel essentiell. In den
beiden Beispielen der nicht-eindeutigen
Schmelzkurven Nr. 6 und 7 in Abbildung 3 ist
dies der Schmelzpunkt des CQR-Schmelzkurventyps
„2R”. In Zweifelsfällen ist immer von
der Anwesenheit eines CQR-Allels in niedriger
Kopienzahl auszugehen – entsprechend
einer niedrigen Parasitämie der CQR-Malarialinie.
Das bedeutet die Anwesenheit mindestens
eines CQR-Allels in der Probe, was den
sinnvollen Einsatz von CQ als mögliches Antimalariamittel
ausschließt.
Eine Bestätigung des resistenten Genotyps
durch DNA-Sequenzierung aus dem PCR-
Produkt, wie bei den Proben Nr. 6 und 7 durchgeführt,
ist nur bei Proben mit noch gut sichtbaren
Schmelzkurven möglich. In Fällen geringerer
Kopienzahlen des CQR-Allels mit
sehr kleinen bis nur noch ansatzweise sichtbaren
Schmelzkurven kann die DNA-Sequenzierung
nicht erfolgen. In diesen Fällen wird
der „vorsorgliche Verzicht” auf den Einsatz
von CQ empfohlen.
Malaria-Artbestimmung
In allen Blutproben, die mit anderen Testsystemen,
wie zum Beispiel dem generellen Malaria-PCR-Kit
von artus, Malaria-positiv getestet
wurden, kann mit dem Nachweis einer
Schmelzkurve in der CQ-real-time PCR auch
eine sichere Artbestimmung von P. falciparum
erfolgen. Zeigt eine Malaria-positive Blutpro-
Abb. 3: Schmelzkurvenanalyse nach einer CQreal-time
PCR. Die Kurven 1-5 zeigen die
Schmelzkurventypen von CQR (1R, 2R) und CQS
(1S, 2S) Malariaproben, die Nummerierung entspricht
den in Abb. 2 gezeigten Genotypen. Die
Schmelzkurven 6 und 7 entsprechen keinem eindeutigen
Schmelzkurventyp und erwiesen sich
nach Sequenzierung der PCR-Produkte als Überlagerung
der Kurven von 2R und 2S (Doppelinfektion
aus CQR- und CQS-Stämmen von P. falciparum).
Die Schmelzpunkte der „reinen“ Schmelzkurventypen
sind durch die farbigen, senkrechten
Linien markiert und die Temperatur unten angegeben.
be nach der CQ-PCR keine Schmelzkurve,
kann eine P. falciparum-Infektion ausgeschlossen
werden. So wurden bisher alle mikroskopisch
als P. falciparum bestimmten Proben der
laufenden Studie 10 durch eine Schmelzkurve
in der CQ-PCR bestätigt. Darüber hinaus ergaben
sich in 40 von 45 mikroskopisch als Malaria-positiv
bestimmten Proben von P. vivax,
P. malariae oder P. ovale kein Signal in der CQ-
PCR und Schmelzkurvenanalyse. Die restlichen
fünf Proben zeigten in der CQ-PCR zwar
schwache, aber eindeutige Schmelzkurven. In
einer der Proben konnte bislang durch Sequenzierung
des PCR-Produkts aus einer generellen
Malaria-PCR eine Doppelinfektion von P.
vivax und P. falciparum erkannt und das Ergebnis
der CQ-PCR nachträglich bestätigt werden.
Die Sequenzierung der anderen Proben steht
noch aus, kann aber wegen der schwachen
Parasitämie von P. falciparum und einer hohen
Parasitämie der anderen Plasmodium-Art
auch ergebnislos bleiben. In diesen Fällen wird
dann ebenso wie oben der “vorsorgliche Verzicht”
auf den Einsatz von CQ empfohlen.
Zusammenfassung
Der vorgestellte real-time PCR-Test für den
LightCycler ist ein kombiniertes Nachweissystem
für P. falciparum-Infektionen und CQR.
Er stellt eine Ergänzung zum Malaria-PCR-Kit
der Firma artus dar und wird in Kürze als
kommerzielles PCR-Kit unter dem Markennamen
„RealArt ® Malaria CQ Resistance LC PCR
Kit” vertrieben werden.
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Korrespondenzadresse
Dr. Rainer Söller
artus Gesellschaft für molekularbiologische
Diagnostik mbH
Königstraße 4a, D-22767 Hamburg
Tel.: 040-41364753, Fax: 040-41364710
eMail: soeller@artus-biotech.de
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LABORWELT 5. Jahrgang | Nr. 3/2004 | 29