PDF Download - Laborwelt

B L I T Z L I C H T
real-Time PCR
RT-PCR-Resistenznachweis
in der Malariadiagnostik
Hier bieten „Rapid Diagnostic-Tests“, die
auf immunologischen oder molekularbiologischen
Techniken basieren, Alternativen zur
klassischen Malariadiagnostik 1 . Hinsichtlich
einer verbesserten Sensitivität und Spezifität
erreichen einige PCR-Tests Nachweisgrenzen
von weniger als 5 Parasiten/µl Blut bei einer
Spezifität von nahezu 100% 2 . Auch das erste
kommerzielle real-time PCR-Testkit zum generellen
Screening von Malariaparasiten, das
RealArt ® Malaria LC PCR Kit der Firma artus,
zeigte eine gute Routinetauglichkeit in einer
unabhängigen Studie 3 . Das Kit ist inzwischen
entsprechend der EU-Richtlinie für die in-vitro-
Diagnostik (IVD) von EDTA-Vollblut CEzertifiziert.
Eine umfassende Malariadiagnostik erfaßt
auch existierende Chemoresistenzen. Insbesondere
die Ausbreitung Chloroquin-resistenter
(CQR) Malariastämme ist von großer Bedeutung.
Hier ergaben sich durch die Klärung
der funktionellen Rolle des PfCRT-Proteins mit
der in allen untersuchten CQR-Stämmen von
P. falciparum gefundenen K76T-Mutation neue
diagnostische Möglichkeiten 4 . Außerdem erwiesen
sich die Sequenz des pfcrt-Gens und
die der CQR zugrundeliegenden Mechanismen
als artspezifisch für P. falciparum 5 . Danach
Nicole Kasdepke und Rainer Söller, artus GmbH, Hamburg
Ein spezifischer und sensitiver Schnelltest zum kombinierten Nachweis von Plasmodium falciparum
und einer möglichen Resistenz gegen Chloroquin wird vorgestellt. Der Test weist mit
Hilfe der real-time PCR das pfcrt-Gen von P. falciparum sowie in einer anschließenden Schmelzkurvenanalyse
dessen K76T-Punktmutation als Ursache der Chloroquin-Resistenz nach. Chloroquin-resistente
und -sensitive Stämme von P. falciparum zeigen gut unterscheidbare Schmelzkurven,
die auch in Doppelinfektionen erkannt werden. In einer laufenden Untersuchung an
klinischen Proben importierter Malaria zeigte die PCR-Methode 100% Übereinstimmung mit der
Artbestimmung nach Routinediagnostik. Die Vorteile der real-time PCR liegen in einer sicheren
Bestimmung von P. falciparum – auch in Fällen von Doppelinfektionen mit einer zweiten Malaria-Art
oder bei niedriger Parasitämie von P. falciparum in der frühen Infektionsphase. Der Test
bietet somit eine schnelle und sichere Diagnostik von P. falciparum und ein Monitoring möglicher
Chloroquin-Resistenzen in einem Ansatz.
Key Words: Malaria tropica, Plasmodium falciparum, real-time PCR, Chloroquin-Resistenz
In der Routinediagnostik der Malaria ist die
Mikroskopie weltweit immer noch der “Gold-
Standard”. Allerdings stößt diese klassische
Analysemethode an ihre Grenzen, wenn qualifiziertes
Personal fehlt und viele Blutproben
mit potentiell niedriger Parasitämie zu analysieren
sind. Dabei sind Blutproben mit niedriger
Parasitämie grundsätzlich ein Problem, da
die durchschnittliche Sensitivitätsgrenze der
meisten Routinelabore nur zwischen 50 und
500 Parasiten/µl beim “dicken Tropfen” liegt,
im Blutausstrich sogar nur bei 5000 Parasiten/
µl 1 . Zusätzlich kann die Sicherheit der mikroskopischen
Analyse von Faktoren wie persönlicher
Erfahrung des Personals, dem Vorhandensein
möglicher Doppel- oder Mehrfach-
Infektionen verschiedener Plasmodium-Arten
sowie dem Fehlen eindeutiger Entwicklungsstadien
relativ stark beeinträchtigt werden.
Abb. 2: Partielles Alignment von DNA-Sequenzen der K76T-Region des pfcrt-Gens von P. falciparum
(Codons 71-81 des PfCRT-Proteins). Das für CQR oder CQS verantwortliche Codon 76 ist eingerahmt und
die entscheidende Transversion A/C fett markiert. Nr. 1 und 3-7 wurden durch Sequenzierung der CQ-
PCR-Produkte aus klinischen Blutproben gewonnen. Die Sequenzen Nr. 1-5 sind aus [5]* bekannt, Nr. 2
wurde in dieser Studie noch nicht gefunden und das PCR-Produkt zu Kontrollzwecken daher synthetisch
hergestellt (Geneart, Regensburg). Punkte im Alignment bedeuten dasselbe Nukleotid wie in Nr.
1, abweichende Basenpositionen sind im IUPAC Code angegeben. Unter [MT] und [TM] sind die
Schmelzkurven-Typen (R=CQR, S=CQS) und die experimentell bestimmten Schmelzpunkte in °C angegeben
(siehe Abb. 3). * Genbank-Nummern af468006, af233065, af233067, af233064, af233066.
Abb. 1: Orientierung und Funktion von Primern
und Sonden der CQ-real-time PCR aus [7] nach
dem Prinzip von [9]. Der intern mit LC640 markierte
reverse Primer dient nach Verlängerung
während der PCR als Anker-Sonde. Die spezifische
Anregung von LC640 erfolgt nach Hybridisierung
der am 3’-Ende mit Fluorescein markierten
Sensor-Sonde. Die Sensor-Sonde erlaubt
eine sehr sensitive Differentialdiagnostik der
CQR-Allele durch Schmelzkurvenanalyse im
LightCycler nach der PCR. Die relative Lage der
für die CQ-Resistenz verantwortlichen Transversion
A/C ist eingezeichnet.
wurden von verschiedenen Arbeitsgruppen
unterschiedliche PCR-Tests zum Nachweis der
K76T-Mutante in CQR-Stämmen von P. falciparum
vorgestellt 6-8 .
Entwicklung
des real-time PCR-Systems
Die hier vorgestellte CQ-PCR ist eine Weiterentwicklung
der real-time PCR von de Monbrison
et al. 7 , wobei die relative Orientierung
und Fluoreszenzmarkierung von Primern und
Sonde beibehalten wurde (Abb. 1). Nur mit
dieser erstmals von Lay et al. 9 für den
LightCycler beschriebenen Variante von markierter
Sensor-Sonde und dem in der PCR verlängerten
markierten Primer als Anker-Sonde
war in der A/T-reichen Zielsequenz um die
K76T-Mutation eine stabile real-time-PCR mit
Schmelzkurvenanalyse realisierbar. Obwohl
die PCR und Schmelzkurvenanalyse mit den
publizierten Sequenzen von Primern und Sonde
prinzipiell funktionierte, wurden beide für
diese Studie im Hinblick auf eine sichere Differenzierung
aller bisher bekannt gewordenen
Schmelzkurventypen weiter optimiert. Im
Rahmen der PCR-Entwicklung wurden zunächst
die Sequenzen von Primern und Sonde
aus [7] in einem Alignment mit den pfcrt-
Sequenzdaten aus [4] verglichen. Dabei ergab
sich das Problem die für die CQR entscheidende
Transversion „A/C” an der zweiten Position
des K76T-Codons möglichst unabhängig
von weiteren, sich stromaufwärts anschließenden
Punktmutationen nachzuweisen. Daher
28 | 5. Jahrgang | Nr. 3/2004 LABORWELT