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LABORWELT

Nr. 6 / 2005 - Vol. 6 Das -Themenheft

Verbesserte

Labordiagnostik mit

Leukämie-Chip

Diagnostische Peptide

in Krebsprognose und

Therapie

Molekulardiagnostik

Tiermodelle: European

Conditional Mouse

Mutagenesis Program

Marktübersicht:

Diagnostische PCR

und Chipanalyse

Gendiagnostik:

Handlungsbedarf aus

Industriesicht

Molekulare Bildgebung

von Gehirntumoren

Microarray-Diagnostik

von Allergenen

BIOCOM AG


DR. CHRISTIAN KLEIN,

GESUNDHEITSPIONIER,

Er forscht für Ihr Leben gern.

IST DEM KREBS AUF DER SPUR.

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auf der MEDICA 2005

In Düsseldorf

16. bis 19. November 2005

Halle 2, Stand A07

Gemeinsam mit rund 10.000 Mitarbeitern

von Roche Diagnostics in Deutschland

arbeitet Dr. Christian Klein an Innovationen

für die Gesundheit. Mit Hilfe modernster

molekularbiologischer Verfahren forscht er

nach neuen Ansätzen in der Krebstherapie.

So kann er biologische und chemische

Substanzen schneller daraufhin überprüfen,

ob sie sich zur Behandlung von Krebs

eignen. Vielversprechende Wirkstoffe lassen

sich auf diese Weise schneller finden – und

zu Medikamenten weiterentwickeln, die die

Therapiechancen und somit die Lebensqualität

von Krebspatienten verbessern.

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Zum Thema


Molekulare Medizin

auf dem Prüfstand

Nach Jahrzehnten des Stillstands rückt ein wachsendes Verständnis

der molekularen Ursachen von Krebs eine bessere Diagnose, Prognose

und schließlich auch gezieltere Therapien in greifbare Nähe. Diese

neue Hoffnung der Krebsforscher formulierte DKFZ-Chef Prof. Dr.

Otmar Wiestler Mitte September auf einer Veranstaltung des Bundesforschungsministeriums

in Berlin. Als erstes profitversprechendes

Anwendungsfeld des aus dem Humangenomprojekt genährten Erkenntniszuwachses

haben Pharmafirmen wie Roche oder Bayer die

molekulare Diagnostik ausgemacht: Neben PCR-basierten Gentests

befinden sich bei den Unternehmen Multiplex-Verfahren wie etwa

Microarrays zur Diagnose von Leukämien (siehe Seite 6 ff.) und anderen

Krebsarten in der Entwicklung. Ein Chip, der eine Voraussage

darüber ermöglicht, wie schnell Medikamente in der Leber abgebaut

werden, ist bereits am Markt. Ziel dieser Forschungsanstrengungen

ist es, die Therapie- und Medikamentenauswahl sowie -dosierung

besser auf den individuellen Patienten abzustimmen, eine genauere

Prognose zu ermöglichen und zugleich Targets zu identifizieren, die

sich bei einer möglichst großen Patientengruppe finden.

Bitte nutzen Sie unseren Kennziffer-Service: online unter

www.biocom.de oder auf unserer Fax-Seite (S. 53). Wenn

Sie ein Produkt interessiert, einfach Nummer ankreuzen,

Name und Adresse angeben und faxen/mailen – Sie

erhalten umgehend Informationen unserer Inserenten.

Interessenvertretungen (siehe S. 4) und Politik unterstützen den neuen

Hype der „individualisierten Medizin“ nach Kräften und versuchen

derzeit, Barrieren zu beseitigen, die einer Vermarktung entgegenstehen.

Ob dies tatsächlich eine signifikante medizinische Verbesserung zu vertretbaren

Kosten erbringt, wird letztlich die Prüfung der Tests ergeben.

Einen Überblick über PCR- und Array-Diagnostika haben wir für Sie in

unserer Marktübersicht (siehe S. 43 ff.) zusammengestellt.

Neben der Expressions- und Proteinanalyse auf Chips oder Strips

(siehe S. 39) bieten besonders nicht-invasive, bildgebende Verfahren

einen neuen Zugang zum molekularen Krankheitsgeschehen.

Empfindliche MRT-, Lumineszenz- und PET-Verfahren eröffnen die

in vivo-Beobachtung der Genexpression (siehe Seite 16) oder von

molekularen Tracern (siehe Seite 21), die sich als Biomarker, aber auch

zur Identifizierung bisher unbekannter Targets eignen.

In unserer neuen themenübergreifenden Rubrik Tech-Transfer (S. 40-

42) möchten wir Wissenschaftlern eine Plattform bieten, um aktuelle

Research Tools und Dienstleistungen vorzustellen. Über Ihre Anregungen

zu diesem neuen Angebot würden wir uns sehr freuen.


Thomas Gabrielczyk

Abstrakte Darstellung des Erbmoleküls DNA, der stofflichen

Grundlage der heute vermarkteten PCR- und

Chip-basierten In vitro-Diagnostica.

© Getty Images, Photodisc Collection

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I N T R O

INHALT

S T A T E M E N T

� Gendiagnostik: Informationelle Selbstbestimmung 4

ist unverzichtbar

Dierk Meyer-Lüerßen, Geschäftsführer,

Verband der Diagnostica-Industrie, Frankfurt am Main

R E P O R T

� Genexpressions-Analysen bei Leukämien: 6

Diagnostik der Zukunft?

Prof. Dr. Dr. Torsten Haferlach et al., MLL GmbH, München

W I S S E N S C H A F T

� Klinische Relevanz des Serumproteins Fetuin-A

– eines Regulators der Kalzifizierung 10

Dr. Vincent Brandenburg et al., Klinikum RWTH Aachen

B L I T Z L I C H T

� Molekulare Bildgebung von Gehirntumoren 16

Prof. Dr. Andreas Jacobs et al., MPI f. neurolog. Forschung, Köln

B L I T Z L I C H T

� Diagnostische Peptide: Spezifische Darstellung 21

und Therapie von Krebserkrankungen

Dr. Sabine Zitzmann et al., Schering AG, Berlin

W I S S E N S C H A F T

� Präparative Aufreinigung von Organellen 24

mit Immuno-Freeflow-Elektrophorese

Dr. Christoph Eckerskorn et al., BD Diagnostics, Martinsried

B L I T Z L I C H T

� Association Studies of Complex Diseases 27

Greg Yap, Affymetrix Inc., Santa Clara, USA

N E T Z W E R K

� EUCOMM – European Conditional Mouse 31

Mutagenesis Program

Prof. Dr. Wolfgang Wurst et al., GSF – Forschungszentrum

für Umwelt und Gesundheit, Neuherberg

B L I T Z L I C H T

� Microarray-Diagnostik von Allergenen 34

Dr. Eva Ehrentreich-Förster et al., FhG IMBT, Nuthetal

B L I T Z L I C H T

� Brustkrebs-Früherkennung mit SELDI-MS 39

Dr. Christine König et al., LifeLines GmbH, Husum

� T E C H-T R A N S F E R

Diagnostik-Array-Service; Kinom-Array; 40

Tool für siRNA-Effizienz;

M A R K T Ü B E R S I C H T

� Diagnostische PCR- und Array-Analyse 43

� Stellenmarkt/Verbände 49

� Produktwelt 51

� Fax-Seite 53

� Termine/Impressum 54

LABORWELT 6. Jahrgang | Nr. 6/2005 | 3


Statement


Die vorgezogene Bundestagswahl und ihr

verwirrendes Ergebnis haben ein Gesetzesvorhaben

gehemmt, das für die künftige Nutzung

der Labordiagnostik von großer Bedeutung

ist: das Gendiagnostik-Gesetz. Durch

dieses Gesetz sollen die Rechte der Menschen

definiert und geschützt werden, die sich zur

Früherkennung vorhandener Krankheiten,

zur Abschätzung von Krankheitsrisiken sowie

zur Diagnose einem Gentest unterziehen.

Ein klarer Rechtsrahmen kann der Akzeptanz

der Gendiagnostik nur gut tun.

Gentests sind heute in der Medizin bereits

weit verbreitet. Allerdings wird ihr wirtschaftliches

Potential meist weit überschätzt.

Von den rund 1,8 Milliarden Euro, die die

gesamte Diagnostika-Industrie in Deutschland

umsetzt, entfallen nach Schätzungen

des VDGH gerade einmal acht Millionen

auf industriell gefertigte Gentests. Ein deutlich

größeres Volumen dürften die Gentests

erreichen, die individuell in Forschungseinrichtungen

und Laboren entwickelt werden,

keinen industriellen Maßstab erreichen und

damit kaum erfaßt werden können.

Nimmt man alle molekularbiologischen

Testverfahren zusammen, die der Labor-

EBM als Kassenleistung enthält, dann dürfte

die Zahl der pro Jahr durchgeführten Tests

bei niedergelassenen Laborärzten, Kliniken

und genetischen Instituten etwa eine Million

erreichen.

Hoher medizinischer Nutzen

In deutlichem Kontrast zu ihrer noch sehr

geringen wirtschaftlichen Bedeutung steht

der medizinische Nutzen der Gendiagnostik.

Ohne sie sind viele Diagnosen gar nicht möglich.

Ihre Ergebnisse sind aussagekräftiger

und genauer als die herkömmlicher labormedizinischer

Verfahren.

Dank Gentests läßt sich bestimmen, ob

Kranke auf bestimmte Medikamente ansprechen

oder nicht und die Behandlung danach

ausrichten. Daher wird diese Entwicklung

von vielen als willkommener Fortschritt

hin zu einer individualisierten Medizin

betrachtet.

L E S E R F O R U M

Gendiagnostik:

InformationelleSelbstbestimmung

ist unverzichtbar

Dierk Meyer-Lüerßen

Geschäftsführer des Verbands der Diagnostica-Industrie (VDGH)

Umgekehrt wird die Aussagekraft dieser

Tests aber auch als Gefahr gesehen. Kommen

die Daten in falsche Hände, kann dem einzelnen

zweifellos Schaden entstehen. Dies

gilt insbesondere für prädiktive Gentests

– also voraussagende Tests, mit denen genetische

Anlagen erkannt werden sollen, die in

der Zukunft zum Ausbruch einer Krankheit

führen können, aber nicht müssen.

Denn die Art und Weise, in der sich Gene

auf den einzelnen auswirken, ist äußerst

komplex. Bei bestimmten seltenen Krankheiten

liefern Prüfungen auf der Grundlage

der Nukleinsäure nahezu kategorische

Informationen über das Krankheitsrisiko.

In anderen Fällen sind ererbte Faktoren

von vergleichbarer Bedeutung wie externe

Faktoren, beispielsweise Ernährung und

Lebensstil.

Regelungen statt Totalverzicht

Gerade solche prädiktiven Tests werfen in

mehrfacher Hinsicht ethische Fragen auf:

Was nutzt es einem Betroffenen, durch einen

Gentest zu wissen, daß er vermutlich

– sagen wir – an Alzheimer erkrankt, es

aber keine kausale Therapie dagegen gibt?

Könnten nicht Arbeitgeber die Einstellung

oder Förderung von Mitarbeitern von den

Ergebnissen solcher Tests abhängig machen?

Bleibt Betroffenen jeglicher Lebens- oder

Krankenversicherungsschutz versperrt, weil

die Versicherungen das Risiko ablehnen?

Die Antwort auf solche Fragen kann jedoch

nicht auf den Verzicht auf die neuen

Diagnosemöglichkeiten hinauslaufen. Dazu

bieten diese modernen Testverfahren viel zu

viele Chancen, um Krankheiten aufzuspüren,

zu verhindern oder ihren Verlauf positiv

zu beeinflussen.

Die Antwort kann nur lauten: Es muß

genau und verläßlich geregelt werden, wann

genetische Dispositionen ermittelt werden

dürfen, wie und ob sie dem Betroffenen nah

gebracht werden und wie Ärzte und Wissenschaft

die Ergebnisse verwenden dürfen, wie

sie gespeichert und geschützt werden und

wer sie nicht verwenden darf.

Nach seinem Studium der Rechtswissenschaft

in Heidelberg und Hamburg

trat Dierk Meyer-Lüerßen in die

Rechtsabteilung des Bundesverbandes

der Pharmazeutischen Industrie e.V.

ein. Seine Aufgabengebiete waren

Referatsleiter Abteilung öffentliches

Recht, Kartellrecht und internationales

Recht. Nach siebenjähriger Tätigkeit

wechselte er 1982 als Geschäftsführer

zum Verband der Diagnostica-Industrie

e.V. Meyer-Lüerßen ist seit 1980 in Arbeitsgruppen

der European Diagnostic

Manufacturers Association tätig und

war von 1995 bis 2003 auch Mitglied

in deren Vorstand. Seit 1978 hat er die

Zulassung als Rechtsanwalt in Frankfurt,

Schwerpunkt Diagnostika-Recht, er ist

Mitautor des „Wiko“ und des „Handbuch

des Medizinprodukterechts“.

Der Verband der Diagnostica-Industrie

hat sich daher frühzeitig für eine gesetzliche

Regelung ausgesprochen. Denn ohne

Rahmenbedingungen, die die Rechte des

Individuums an seinen Gendaten sowie den

Umgang mit den Ergebnissen von Gentests

exakt regeln, ist keine öffentliche Akzeptanz

dieser wichtigen Testverfahren zu erwarten.

Auf diese Akzeptanz und auf diese Verfahren

können und sollten insbesondere die Patienten

nicht verzichten.

Rahmen für ein Gendiagnostik-Gesetz

Der Verband der Diagnostica-Industrie

nimmt folgende Position ein:

– Individuelle genetische Informationen

sind persönlich und privat. Nur ihr

Besitzer darf entscheiden, ob sie mittels

genetischer Testung erlangt werden sollen

und wozu sie verwendet werden dürfen.

Weder Arbeitgeber noch Versicherungsunternehmen,

weder Regierungen noch

medizinische Fachkräfte dürfen solche

Entscheidungen treffen.

– Alle persönlichen medizinischen Informationen,

einschließlich der durch Gentests

4 | 6. Jahrgang | Nr. 6/2005 LABORWELT


erlangten Daten, sind vertraulich. Allein der Betroffene hat das

Recht, über die Nutzung der Daten zu entscheiden.

– Genetische Prüfungen dürfen nur mit zuvor erteilter Einwilligung

(„informed consent“) durchgeführt werden. Der Begriff „informed

consent“ umfaßt die vollständige Darlegung von Nutzen, Risiken

und Grenzen der Prüfung, einschließlich Alternativen zu den

Prüfungen sowie therapeutische und präventive Möglichkeiten

nach der Prüfung.

– Eine genetische Prüfung sollte nur durchgeführt werden, wenn

dadurch dem Betroffenen oder seiner Familie ein Nutzen entsteht,

zum Beispiel eine Therapie möglich ist oder – auch das ist wichtig

– wenn ihm durch einen Test die vielleicht unbegründete Angst

vor einer Erkrankung genommen wird.

– Die Ergebnisse genetischer Prüfungen sollten dem Betroffenen

durch Fachkräfte und Psychologen erläutert werden. Er darf mit

den Ergebnissen nicht alleingelassen werden.

Der bisherige Entwurf des Gendiagnostik-Gesetzes wird diesen

Forderungen weitgehend gerecht. Er stellt den Menschen in den Mittelpunkt

und gesteht ihm umfassende informationelle Freiheiten zu.

Der Betroffene behält jederzeit die Kontrolle über seine genetischen

Daten. Er kann jederzeit die Einwilligung zu Untersuchungen und

zur Verwendung der Ergebnisse widerrufen. Er kann es ablehnen,

die Ergebnisse einer Untersuchung zu erfahren und die Ergebnisse

vernichten lassen. Wichtig ist allerdings auch, daß ein zukünftiges

Gendiagnostik-Gesetz den berechtigten Interessen der medizinischen

Forschung Rechnung trägt.

Kein Ende der Pauschalkritik an Gentests?

Der VDGH verbindet mit dem Gendiagnostik-Gesetz die Hoffnung,

daß durch die neuen Regelungen der Pauschalkritik an den neuen

Testverfahren der Wind aus den Segeln genommen und einer Blockade

der genetischen Untersuchungen entgegengewirkt wird.

Einen kleinen Wermutstropfen gibt es jedoch: Es ist bedauerlich,

daß die Gendiagnostik in eine Sonderrolle gedrängt wird. Die jetzt

geplanten Bestimmungen müßten auf alle medizinischen Tests und

die daraus gewonnenen persönlichen Daten angewandt werden. Es ist

nicht einzusehen, weshalb die Gefahr des Mißbrauchs der Ergebnisse

von Gentests größer und die Folgen schwerwiegender sein sollen als

von anderen medizinischen Test mit hohem Informationsgehalt.

Aus wissenschaftlicher Sicht sind alle genetischen Daten Teil eines

Gesamtspektrums an medizinischen Informationen und können

nicht als getrennte Kategorie betrachtet werden. Da sich bei allen

medizinischen Daten der Informationsgehalt in Abhängigkeit zu den

jeweiligen Gegebenheiten grundlegend ändern kann, sollten sie alle

denselben strengen Anforderungen an die Datenqualität entsprechen

und dasselbe hohe Maß an Vertraulichkeit genießen. Besondere

Erwägungen, soweit sie in Anbetracht des Informationsgehaltes

angemessen sind, sollten stets auf den Träger der Information, nicht

aber auf die Information als solche bezogen sein.

Auch bei anderen Tests ethische Probleme

Auch – um ein Beispiel zu nennen – die bildgebende Diagnostik kann

ähnliche ethische Probleme aufwerfen, etwa wenn der Diagnose

keine Therapie folgen kann oder ein potentieller Arbeitgeber von

einem negativen Ergebnis erfährt und die Einstellung verweigert.

Nur weil bei den neuen Tests das Erbgut des Menschen untersucht

wird, soll offensichtlich mit zweierlei Maß gemessen werden.

Erfreulicherweise teilt der Nationale Ethikrat in diesem Punkt

die Haltung der Diagnostika-Hersteller und trifft in seiner Stellungnahme

zur prädiktiven Diagnostik keine Unterscheidung zwischen

Gendiagnostik und herkömmlichen Verfahren.

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DNA-Microarrays


R E P O R T

Genexpressionsanalysen

bei Leukämien:

Diagnostik der Zukunft?

Prof. Dr. Dr. Torsten Haferlach, PD Dr. Susanne Schnittger, PD Dr. Wolfgang Kern,

PD Dr. Claudia Schoch, MLL Münchner Leukämielabor GmbH

Eine umfassende Leukämiediagnose beruht auf einer individuellen Kombination verschiedender

Methoden. So kommen parallel eine Kombination von Zytomorphologie, Zytochemie,

Zytogenetik, Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung, Durchflußzytometrie und PCR-basierten

molekulargenetischen Methoden zum Einsatz. Seit kurzem ermöglicht nun die Technik der

Genexpressionsanalyse mit Microarrays eine simultane Expressionsmessung von Zehntausenden

Genen. Die spezifische Signatur erlaubt anschließend das Erstellen eines molekularen

Fingerabdrucks. Es ist zu erwarten, daß die Anwendung von Microarrays zu einer verbesserten

molekularen Diagnostik, zu Fortschritten im pathogenetischen Verständnis von malignen und

benignen Erkrankungen sowie zur Entwicklung neuer Therapieoptionen führen wird. Es ist

darüber hinaus sehr wahrscheinlich, daß mit den Ergebnissen aus Microarray-Experimenten

neue, krankheitsspezifische Zielmoleküle für maßgeschneiderte Medikamente sowie

individuelle Gene zum Nachweis minimaler Resterkrankung identifiziert werden. Neuere

Studien weisen auch darauf hin, daß sich Expressionsprofile mit prognostischen Parametern

korrelieren lassen. Auf der Basis von Genexpressionsprofilen könnte die Leukämiediagnostik

in absehbarer Zeit auf einer einzigen Plattform schnell, robust und – bei entsprechender

Anwendung – auch kostengünstiger als bisher erfolgen.

Key Words: Leukämie, Diagnostik, molekulare Marker, Genexpressionsanalyse, Microarrays

Abb. 1: Schematische Darstellung der Microarray-Technologie. Bei den DNA-Oligonukleotid-

Microarrays (linke Seite) wird pro Experiment eine Probe hybridisiert. Die Detektion erfolgt durch

einen Fluoreszenzfarbstoff und ergibt für jedes Gen einen absoluten Expressionswert. Bei den

gespotteten Microarrays (rechte Seite) wird die Test-RNA mit einer Kontroll-RNA co-hybridisiert.

Beide RNA-Spezies werden mit unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen markiert. Nach Detektion

des Fluoreszenzsignals ergibt sich ein Verhältnis aus Test- und Kontroll-RNA. Im Schema

ist die Test-RNA überrepräsentiert, was einem überexprimierten Gen entspräche.

Kennziffer 13 LW 06 · www.biocom.de �

Die Leukämiediagnostik und -klassifikation

beruhte bisher zum Teil auf relativ subjektiven

Kriterien: Bei der klassischen Methode

der Diagnostik – die Zytomorphologie und

die Histologie – müssen sogenannte Blasten

quantifiziert werden. Zur genaueren Klassifikation

dann ergänzend die Zytochemie zu

Rate gezogen. Daneben kommen die Multiparameter-Immunphänotypisierung,Zytogenetik,

Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung und

die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) zur

Anwendung. Häufig führt nur eine Kombination

der genannten Methoden zur Diagnose

der jeweiligen Sub-Entität und zur Wahl der

spezifischen Therapie 1 . Mit der Microarray-

Technologie hat sich in den vergangenen fünf

Jahren zunächst in der Forschung eine neue

Methode etabliert, die eine Verbesserung der

Klassifikation von Leukämien zu ermöglichen

scheint und damit in absehbarer Zeit

auch für die Routine-Diagnostik eingesetzt

werden könnte.

Microarray-Plattformen

Zwei verschiedene Methoden können unterschieden

werden: DNA-Oligonukleotid-Microarrays

und cDNA-gespottete Arrays (Abb.

1). Auf den DNA-Oligonukleotid-Microarrays

werden genspezifische Sequenzen an

definierten Positionen auf dem Microarray insitu

synthetisiert. Die zu untersuchende Probe

(ca. 5 µg Gesamt-RNA; entspricht ca. 1-8 x 10 6

Zellen) wird in cDNA umgeschrieben und in

einer nachfolgenden in-vitro-Transkription

amplifiziert. Dabei werden von der T7-RNA-

Polymerase biotinylierte Ribonukleotide in

die wachsenden cRNA-Stränge inkorporiert.

10 µg fragmentierte und Biotin-markierte

cRNA werden pro Experiment auf dem Microarray

hybridisiert. Die Detektion erfolgt

nach Anfärben der DNA-cRNA-Hybride

mit Streptavidin-Phycoerythrin mittels eines

Argon-Ionen-Lasers. So finden sich beispielsweise

auf dem aktuellen HG-U133 2.0 plus

Microarray der US-Firma Affymetrix rund

40.000 humane Gene durch jeweils 11 verschiedene

Oligonukleotide repräsentiert. Als

interne mismatch-Kontrolle werden ebenfalls

sequenzspezifische Oligonukleotide mit einer

zentralen Punktmutation verwendet. Die

Ergebnisse sind sehr gut reproduzierbar.

Bei der Auswahl der Proben muß auf eine

möglichst homogene Zellzusammensetzung

geachtet werden. Leukämieproben haben

aber meist einen Anteil von mehr als 70% malignen

Zellen – speziell nach Ficoll-Gradient

– und bieten deshalb für Genexpressionsanalysen

eine gute Grundlage.

Eine umfassende, biomathematisch gestützte

Analyse der Ergebnisse, die auf verschiedene

Algorithmen zurückgreifen muß,

kann heute nur zum Teil durch bereits mit-

6 | 6. Jahrgang | Nr. 6/2005 LABORWELT


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R E P O R T

Abb. 2: Hierarchische Cluster-Analyse. Anordnung der Genexpressionsmuster nach Ähnlichkeiten

mittels Software: Die Patienten werden in Spalten, die Gene in Reihen dargestellt. Rot steht

für „stark exprimiert“, grün für „schwach oder nicht exprimiert“.

gelieferte Software-Lösungen gewährleistet

werden. Es empfiehlt sich daher unbedingt,

Unterstützung durch eine versierte Biostatistik

oder Bioinformatik zu nutzen, um nicht

trotz gelungener Analysen vor der Datenflut

kapitulieren zu müssen (Abb. 2).

Eine Vielzahl unterschiedlicher Fragestellungen

wurde in den vergangenen Jahren

mit Hilfe von Microarrays bearbeitet.

Neben neuen Erkenntnissen zu pathophysiologischen

und ontogenetischen Zusammenhängen

sind insbesondere die Daten

zu malignen Erkrankungen von Interesse.

Nach einer bahnbrechenden Arbeit von

Golub am Beispiel der akuten Leukämien

im Jahre 1999, die eine vielversprechende

Anwendbarkeit der Microarray-Technologie

beschrieb und neue biostatistische

Abb. 3: Zweidimensionaler hierarchischer Cluster dreier unterschiedlicher, genetisch definierter

AML-Subgruppen (AML mit t(8;21); bzw. AML mit t(15;17); bzw. AML mit inv(16); jeder einzelne

Patient entspricht einer Spalte anhand informativer, differentiell exprimierter Gene (in Reihen

angeordnet).

Grundlagen aufzeigte, stehen aktuell zunehmend

Detailanalysen im Vordergrund.

Diese ermöglichen nicht nur eine sogenannte

“class prediction“ – also die Voraussage

einer Tumorart, basierend auf spezifischen

Genexpressionsprofilen ausgewählter informativer

Gene 2-7 –, sondern auch eine “class

discovery“ – das Entdecken neuer Sub-Entitäten

in bisher nicht weiter unterscheidbaren

Tumorproben verschiedener Patienten 5 .

Dabei werden im Einzelfall bereits in ersten

Arbeiten unterschiedliche Prognosegruppen

identifiziert. Dies wird mittelfristig über den

reinen Diagnostikaspekt hinaus auch therapeutische

Konsequenzen haben.

Bisherige Ergebnisse

Wir konnten zeigen, daß die zytogenetisch

definierten AML-Subtypen AML mit t(8;21),

t(15;17) und inv(16) spezifische Expressionsprofile

zeigen. Durch die definierten

Veränderungen des Karyotyps werden

Genexpressionsmuster hervorgerufen, die

mit Microarrays erfaßt werden können. Die

Expression eines Minimalsets von nur 13

Genen war letztlich ausreichend, um den

Karyotyp der jeweiligen AML-Probe vorherzusagen

(Abb. 3, 4) 8,9 .

Wie robust aber schon jetzt die Genexpressionssignaturen

sind, zeigen vergleichende

Analysen von Proben, bei denen wir publizierte

Gene von kindlichen Leukämien verwendet

haben 6,7 , um gleiche Leukämie-Entitäten

bei Erwachsenen zu klassifizieren. Dies

gelang mit einer Genauigkeit von 100% 10 .

Ebenso ließ sich eine gute Korrelation der

Proteinexpression, gemessen durch die

Multiparameter-Immunphänotypisierung

mit den dazu gehörigen Genexpressionshöhen

gleicher kodierender Gene, auf dem

Microarray nachweisen 11 .

Ebenso untersuchten wir den Einfluß der

Zeit von der Entnahme der Leukämieprobe

bis zur Aufarbeitung des Materials im Labor

und fanden eine extrem hohe Stabilität des

Musters von Genen, durch die die Leukämie

charakterisiert wird 12 .

In einer Analyse mit insgesamt 937 Patientenproben

von 12 verschiedenen, klinisch

relevanten Leukämie-Subgruppen gelang

es uns – auch im Vergleich mit gesundem

Knochenmark – eine Voraussagegenauigkeit

des Leukämie-Subtyps von 95,1% zu

erreichen 13 .

MILE-Studie

In einer großen prospektiven Studie (Microarray

Innovations in LEukemia, MILE-

Studie) unter unserer wissenschaftlichen

Leitung und unter Federführung von Roche

Diagnostics wird derzeit prospektiv an 4.000

Proben der Wert von Microarrays für eine

zukünftige Routinediagnostik bei Leukämien

untersucht. Die MILE-Studie wird Anfang

8 | 6. Jahrgang | Nr. 6/2005 LABORWELT


2007 abgeschlossen sein. Gerade Studien, die

parallel die genannten Standardmethoden

der Leukämiediagnostik und Microarrays

am gleichen Material auf Klassifikations-

Genauigkeit, Sensitivität und Spezifität

untersuchen, sind dringend notwendig. Dies

muß durch umfassende Software und – angesichts

der großen Datenmengen – auch

Hardware unterstützt werden. Obwohl die

Aufarbeitung der Leukämieproben sich im

Rahmen eines standardisierten Arbeitens

eines molekularen Settings bewegt, sind

viele Aspekte der Gen-Auswahl, der bio-

Abb. 4: Hauptkomponentenanalyse der gleichen

AML-Patienten, basierend auf den unterschiedlichen

Genexpressionsintensitäten.

Jede einzelne AML-Patientenprobe wird durch

eine farblich kodierte Kugel in einem dreidimensionalen

Raum repräsentiert. Patientenproben

mit ähnlichen Genexpressionsprofilen

befinden sich in räumlicher Nähe zueinander

und lassen sich in allen Fällen von den anderen

AML-Subgruppen abgrenzen.

statistischen Analyse und der klinischen

Relevanz noch zu prüfen. Dies gilt umso

mehr, wenn es um Aussagen zur Prognose

und zur Therapiesteuerung gehen soll.

Fazit

Microarrays ermöglichen eine umfassende

simultane Expressionsanalyse von Zehntausenden

Genen. Die gemessene spezifische

Signatur erlaubt anschließend die Erstellung

eines molekularen Fingerabdrucks. Es ist

zu erwarten, daß die Anwendung von Microarrays

zu einer verbesserten molekularen

Diagnostik, zu Fortschritten im pathogenetischen

Verständnis von malignen und

benignen Erkrankungen sowie zur Entwicklung

neuer Therapieoptionen führen wird.

Es ist darüber hinaus sehr wahrscheinlich,

daß mit den Ergebnissen aus Microarray-

Experimenten neue, krankheits-spezifische

Zielmoleküle für maßgeschneiderte Medikamente

identifiziert werden. Dabei wird

die Zahl der Gene, die für eine bestimmte

Frage gemessen werden muß, überschaubar

sein. Schon mit weniger als 100 Genen ließ

sich vorhersagen, um welchen Tumor es sich

handelt. Diese Gene müssen mit Hilfe modernster

und komplizierter Statistik-Modelle

und viel Software und Hardware aber erst

„erarbeitet“ werden. Neuere Studien weisen

darauf hin, daß sich Expressionsprofile auch

mit prognostischen Parametern korrelieren

lassen.

Auf der Basis von Microarrays und Genexpressionsprofilen

könnte jedoch schon in

naher Zukunft die Leukämiediagnostik auf

einer einzigen Plattform schnell, robust und

– bei entsprechender Anwendung – auch

kostengünstiger erfolgen. Vorerst begleitend

zur täglichen Routinediagnostik wird sich

zeigen, ob einige der bisherigen Methoden

dann sukzessive ersetzt werden können.

Literatur

[1] Haferlach T, Schoch C. Moderne Verfahren in der Leukämiediagnostik.

Internist 2002;43:1190-1202.

[2] Golub TR, Slonim DK, Tamayo P et al. Molecular classification of cancer:

lass discovery and class prediction by gene expression monitoring.

Science 1999;286:531-537.

[3] Ramaswamy S, Tamayo P, Rifkin R et al. Multiclass cancer diagnosis

using tumor gene expression signatures. Proc Natl Acad Sci U S A

2001;98:15149-15154.

[4] Ramaswamy S, Golub TR. DNA microarrays in clinical oncology. J Clin

Oncol 2002;20:1932-1941.

[5] Alizadeh AA, Eisen MB, Davis RE et al. Distinct types of diffuse large

B-cell lymphoma identified by gene expression profiling. Nature

2000;403:503-511.

[6] Armstrong SA, Staunton JE, Silverman LB et al. MLL translocations

specify a distinct gene expression profile that distinguishes a unique

leukemia. Nat Genet 2002;30:41-47.

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and prediction of outcome in pediatric acute lymphoblastic leukemia by

gene expression profiling. Cancer Cell 2002;1:133-143.

[8] Schoch C, Kohlmann A, Schnittger S et al. Acute myeloid leukemias

with reciprocal rearrangements can be distinguished by specific gene

expression profiles. Proc Natl Acad Sci U S A 2002;99:10008-10013

[9] Kohlmann A, Schoch C, Schnittger S, Dugas M, Hiddemann W, Kern W,

Haferlach T. Molecular characterization of acute leukemias by use of

microarray technology. Genes Chromosomes Cancer. 2003;4:396-405.

[10] Kohlmann A, Schoch C, Schnittger S, Dugas M, Hiddemann W, Kern W,

Haferlach T. Pediatric acute lymphoblastic leukemia (ALL) gene expression

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[11] Kern W, Kohlmann A, Wuchter C, Schnittger S, Schoch C, Mergenthaler

S, Ratei R, Ludwig WD, Hiddemann W, Haferlach T. Correlation of

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2003;55:29-36.

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signatures in leukemia. Genes, Chromosomes & Cancer. 2005; 42:299-

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[13] Haferlach T, Kohlmann A, Schnittger S, Dugas M, Hiddemann W, Kern

W, Schoch C. Global approach to the diagnosis of leukemia using gene

expression profiling. Blood. 2005;106:1189-1198.

Korrespondenzadresse

Prof. Dr. Dr. Torsten Haferlach

MLL - Münchner Leukämie Labor GmbH

Max-Lebsche-Platz 31

D-81377 München

Tel.: +49-(89)-99017-0

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LABORWELT 6. Jahrgang | Nr. 2/2005 | 9

Kolibri


Molekularbiologie


Kalzium und Phosphat kommen in Form

von Hydroxyapatit als Knochenmineral vor,

sie sind aber auch essentiell für wesentliche

Stoffwechselprozesse im Körper. Dazu zählen

zum Beispiel der Energiestoffwechsel

und die Signaltransduktion. Dies setzt voraus,

daß jederzeit genügend Kalzium- und

Phosphationen aus dem Knochenreservoir

mobilisierbar und überall im Körper verfügbar

sind. Das Blut und alle Extrazellulärflüssigkeiten

stellen daher hinsichtlich

der Kalzium- und Phosphat-Löslichkeit

sogenannte „metastabile“ Lösungen dar.

Diese Lösungen präzipitieren zwar nicht

spontan Kalziumphosphat, sie ermöglichen

aber permanentes Kristallwachstum und

damit fortschreitende Präzipitation, sobald

sich Kristallkeime gebildet haben.

Regulatoren der Kalzifizierung

Wie ist es dann zu erklären, daß die Mineralisation

nur gezielt in Knochen und Zähnen

stattfindet und nicht in der extrazellulären

Matrix von Weichgeweben?

In mehreren, erst kürzlich erschienen Artikeln

wurde dieser Frage nachgegangen. Es

W I S S E N S C H A F T

Klinische Relevanz des

Serumproteins Fetuin A – einem

Regulator der Kalzifizierung

Dr. Cora Schäfer 1 , Prof. Dr. Willi Jahnen-Dechent 1 und Dr. Vincent Brandenburg 1,2

1 IZKF BIOMAT, 2 Klinik für Nephrologie und klinische Immunologie (Medizinische Klinik II),

Universitätsklinikum der RWTH Aachen

Die bedeutendste Form der extraossären Kalzifizierung im Menschen ist die vaskuläre

Kalzifizierung. Sie begleitet komplizierend die intimale Atherosklerose oder tritt primär als

in der Media lokalisierte Kalzifikation im Rahmen der Arteriosklerose auf. Während in der

Vergangenheit die Weichgewebskalzifizierung – einschließlich der vaskulären Kalzifizierung

– als passiver Prozeß angesehen wurde, der durch Überschreiten eines kritischen Kalzium

x Phosphat-Produktes ausgelöst ist, zeigen neuere Veröffentlichungen, daß dieser Prozeß

durch eine Reihe von Regulatoren moduliert wird. Neben Gewebe-gebundenen lokalen

Hemmstoffen der Kalzifizierung gibt es auch systemische Regulatoren in Blut und Extrazellulärflüssigkeit.

Neben niedermolekularen Modulatoren ist das Plasmaprotein Fetuin-

A/alpha 2 -HS-Glykoprotein der Haupt-Hemmstoff im Blut. Fetuin-A kann Kristallwachstum

verhindern, indem es neu entstehende Kalziumphosphat-Partikel bindet und in löslicher

Form hält, bis sie aus der Zirkulation entfernt werden. Untersuchungen an Fetuin-A-defizienten

Knock out-Mäusen offenbarten massive Weichgewebskalzifizierungen in einer

Reihe von Hauptorganen wie Niere, Lunge und Herz. Klinische Studien haben gezeigt, daß

Dialysepatienten über die bekannten Störungen im Kalziumphosphat-Haushalt hinaus auch

erniedrigte Fetuin-A-Serumspiegel aufweisen. Somit trägt das Fehlen dieses Hemmstoffs

der Kalzifizierung erheblich zur Erhöhung des Kalzifizierungsrisikos bei.

Key Words: Kalzifizierung, Kalziumphosphat, Plasmaproteine, Mausmodell, Fetuin-A,

Atherosklerose

wird deutlich, daß hierfür bestimmte Proteine

als Regulatoren notwendig sind. Murshed

und Mitarbeiter konnten zeigen, daß nur die

Extrazellulärmatrix von Zellen mineralisiert,

in denen das knochenspezifische Strukturprotein

Kollagen-Typ I und gleichzeitig ein

Pyrophosphat-spaltendes Enzym, die Gewebe-unspezifische

alkalische Phosphatase

gebildet werden 1 . Knochenbildende Zellen

(Osteoblasten) produzieren das Enzym alkalische

Phosphatase in sehr großen Mengen und

ermöglichen so die Spaltung des inhibitorisch

auf die Mineralisierung wirkenden Pyrophosphats

sowie anderer Phosphat-haltiger Moleküle,

so daß Phosphat in genügender Menge

für die Knochenbildung zur Verfügung steht.

Demnach unterliegt der regulierte Prozeß der

Mineralisierung offensichtlich einem Gleichgewicht

von aktivierenden und inhibierenden

Mechanismen.

Neben niedermolekularen Faktoren wie

dem genannten Pyrophosphat sind aus

genetischen Studien heute eine Reihe von

Proteinen bekannt, die den Prozeß der Kalzifizierung

modulieren. Die überwiegende

Mehrheit ist durch die gezielte Deletion des

jeweils kodierenden Gens in Knock out-Mäu-

sen identifiziert worden. Das Ausschalten

der Pyrophosphatwirkung – einmal durch

Deletion des für die Produktion notwendigen

Enzyms Ecto-Nukleotid-Pyrophosphatase-Phosphodiesterase

1 (Enpp1) oder

eines Transporters für Pyrophosphat (Ank)

– bewirkt in Mäusen die Kalzifizierung von

Gelenkknorpel. Ein weiteres Paradebeispiel

dafür, daß Proteine die Kalziumphosphat-

Präzipitation spezifisch und ausschließlich in

den Geweben verhindern können, in denen

sie gebildet werden, ist das Matrix-Gla-Protein

(MGP). Dieses weitgehend unlösliche

Protein ist in der Extrazellulärmatrix, in

Arterien und Knorpel lokalisiert. Die MGP-

Knock out-Maus weist erwartungsgemäß

arterielle und Knorpel-Kalzifizierungen auf,

was letztlich zur Ruptur der Aorta wenige

Wochen nach Geburt der Tiere führt.

Fetuin-A, ein systemischer Inhibitor

der Kalzifizierung

Den bisher beschriebenen, lokal wirkenden

Regulatoren der physiologischen Mineralisierung

im Knochen oder der pathologischen

Kalzifizierung in Weichgeweben steht

bislang ein einziges, systemisch inhibierend

wirkendes Plasmaprotein gegenüber, das

Fetuin-A/α 2 -HS-Glykoprotein (genetisches

Symbol: AHSG). Dieses etwa 60 kDa große

Glykoprotein wird in der Leber synthetisiert

und zirkuliert in einer relativ hohen Konzentration

von 0,4-1,0 g/L. Es kann in vitro die

Kalziumphosphat-Präzipitation inhibieren,

indem es mit hoher Affinität an einen Kristallisationskeim

bindet, dessen Wachstum

verhindert und ein kolloidales Aggregat

bildet 2-4 . Diesen löslichen hochmolekularen

Komplex haben wir in Analogie zu den

Lipoprotein-Partikeln, die die Zirkulation

von sonst unlöslichen Lipiden ermöglichen,

Calciprotein-Partikel (CPP) genannt. Einer

groben Schätzung zufolge ist Fetuin-A für

rund 50% des inhibitorischen Effekts von Serum

gegenüber der spontanen Präzipitation

verantwortlich.

Phänotyp der Fetuin-A-Defizienz

Fetuin-A puffert und stabilisiert einen Überschuß

von Kalzium und Phosphat im Blut,

der aus vermehrtem Knochenabbau resultiert

(siehe Abb. 1, S. 12). Die Stabilisierung des

Komplexes ist zwar nur vorübergehend,

aber unter Normalbedingungen ausreichend,

um effizient aus der Zirkulation entfernt zu

werden, so daß es nicht zu Kalziumphosphat-

Ablagerungen kommen kann. Mäusen, die

dieses Protein nicht mehr herstellen können,

fehlt dieser wichtige Stabilisations- und

Wegräum (Clearing)-Mechanismus. Dementsprechend

zeigen Fetuin-A-Knock out-Mäuse

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10 | 6. Jahrgang | Nr. 6/2005 LABORWELT


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W I S S E N S C H A F T

Abb. 1: Regulatoren der Kalzifizierung in Arterien und Weichgeweben. Ein zu hohes Kalzium x

Phosphat-Produkt, meist einhergehend mit einem sekundären Hyperparathyreoidismus, gilt als

Hauptrisikofaktor für ektopische Kalkablagerungen. Daneben gibt es eine Reihe von Proteinen,

die lokal auf bestimmte Stimuli hin im Gewebe exprimiert werden und dort die Kalzifizierung

aktivieren. Dieser Prozeß kann insbesondere bei einem relativen Mangel an Inhibitoren beschleunigt

ablaufen.

A B

Abb. 2: Makroskopische Ansicht von Herz und Lunge von 10 Monate alten Wildtyp- (A) und Fetuin-

A-Knock out-Mäusen (B). Die Organe wurden nach Präparation mit Alizarinrot angefärbt. Während

im Herzen der Knock out-Maus hauptsächlich linienförmige Strukturen positiv gefärbt sind,

waren in den Lungenflügeln eine Vielzahl kleiner rundlicher Kalziumphosphat-Präzipitate nachweisbar.

In den Organen der Wildtyp-Maus konnten keine Kalzifizierungen festgestellt werden.

Kennziffer 16 LW 06 · www.biocom.de �

Weichgewebskalzifizierungen in einer Reihe

von Hauptorganen, wie etwa Lunge, Niere

und Herz 5 (siehe Abb. 2). Bei älteren Fetuin-Adefizienten

Mäusen kommt es aufgrund der

fortschreitenden Kalzifizierung in der Niere

zur Beeinträchtigung der Funktion. Danach

entwickelt sich nach klassischem Muster ein

sekundärer Hyperparathyreoidismus, wie

es auch bei Patienten mit terminaler Niereninsuffizienz

zu beobachten ist 6 .

Nephelometrische Bestimmung

des Fetuin-A-Spiegels im Menschen

Nach anfänglichen Messungen der Fetuin-A-Serumspiegel

mit einem indirekten

ELISA-Assay verwenden wir jetzt die Methode

der Nephelometrie als eine sehr verläßliche

und schnelle Technik zur Messung

der Fetuin-A-Konzentration im Blut.

Die Nephelometrie wird mit dem gleichen

polyklonalen Fetuin-A-Kaninchen-Antikörper

durchgeführt wie vorausgehende

ELISA-Messungen 7 . Die Übertragung der

mittels ELISA gewonnenen Konzentrationen

auf die Nephelometrie-Streulichtmessung

erfolgte durch entsprechende Verdünnungsreihen.

Der polyklonale Fetuin-A-Kaninchen-Antikörper

reagiert nicht mit Fetuin-B,

einem nahe verwandten Protein mit bisher

ungeklärter Funktion 8 . Die Präanalytik

gestaltet sich einfach, da sich Fetuin-A im

Serum auch nach zweitägiger Lagerung bei

Raumtemperatur stabil zeigte. Davon ausgenommen

sind Proben von Patienten mit

Septikämie oder Coagulopathien, die eine

erhöhte proteolytische Aktivität im Serum

aufweisen können 9 .

Die Nephelometriemethode mißt linear

zwischen 0,05 und 2,6 g/L Fetuin-A im

Serum. Die Präzisionswerte sind für die

Intra-Assay-Präzision ein Variationskoeffizient

(VK) von 7,75% und für die Präzision

von-Tag-zu-Tag ein VK von 8,5%.

Normwerte

In einem großem Kollektiv von fast 1.000

nicht dialysepflichtigen Patienten (80% mit

einer glomerulären Filtrationsrate von >60

ml/min, mittleres Alter 67 Jahre) konnte

ein Normwert für Fetuin-A von 0,4-1,0 g/L

definiert werden (siehe Abb. 3, S. 14).

Fetuin-A-Serumwerte sind geschlechtsabhängig.

Frauen haben höhere Werte als

Männer. Darüber hinaus besteht eine Altersabhängigkeit

(siehe Abb. 4, S. 14). Generell

treten bei allen getesteten Tierspezies die

höchsten Fetuin-A-Serumkonzentrationen

in der Phase des stärksten Knochenwachstums

auf, was vermutlich damit zu tun hat,

daß in dieser Phase besonders viel Kalzium

und Phosphat im Körper mobilisiert werden

12 | 6. Jahrgang | Nr. 6/2005 LABORWELT


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5,945,334; 6,054,270; 6,140,044; 6,261,776; 6,291,183; 6,346,413; 6,399,365; 6,420,169; 6,551,817; 6,610,482; 6,733,977; and

EP 619 321; 373 203 and other U.S. or foreign patents.


und das mögliche Risiko ungewollter Kalzifizierung

steigt. Interessanterweise waren

die ersten beobachteten Knock out-Mäuse

mit Kalzifizierung sämtlich ex-schwangere

Weibchen 10 . Über ein ähnlich erhöhtes

Kalzifizierungsrisiko bei schwangeren

Frauen ist nichts bekannt. Allerdings kennt

man das Phänomen der physiologischen

Hyperkalzämie bei Schwangeren und stillenden

Frauen. Es wird damit erklärt, daß

die Mütter große Mengen an Kalzium (und

Phosphat) mobilisieren müssen – zunächst

im Blut, dann in der Muttermilch –, um den

Bedarf des mineralisierenden Skeletts im

Baby zu decken. In dieser Situation sind die

Antikalzifizierungs-Strategien des Körpers

vermutlich besonders aktiv, und zwar erfolgreich,

sonst gäbe es mehr Berichte über

Kalzifizierungen während der Schwangerschaft

oder der Stillzeit.

Klinische Relevanz

des Fetuin-Spiegels

In Dialysepatienten treten vermehrt vaskuläre

Kalzifizierungen als weitere Komplikation

der beschleunigten urämischen

Atherosklerose auf. Das Ausmaß der Kalzifizierung

korreliert mit der Mortalität in

der Dialysepopulation. In einer klinischen

Querschnittsstudie konnten wir zeigen, daß

die Fetuin-A-Plasmakonzentration in Dialysepatienten

signifikant niedriger ist als in

Gesunden. Diese erniedrigte Konzentration

korrelierte mit einer erhöhten kardiovaskulären

Mortalität 7 . Moe und Mitarbeiter

konnten zeigen, daß niedrige Fetuin-A-Serumspiegel

bei Dialysepatienten auch mit

Koronararterienkalzifikation einhergehen 11 .

Fetuin-A ist ein Negativ-Akutphase-Protein,

das heißt, im Verlauf einer Entzündung wird

W I S S E N S C H A F T

Abb. 3: Normalverteilung der Fetuin-A-Serumkonzentration in ca. 1.000 Patienten ohne Dialysepflichtigkeit.

Normalwert 0,4 – 1,0 g/L.

die Plasmakonzentration herunterreguliert.

Da Dialysepatienten quasi permanent einen

Status der Mikroinflammation und somit

erniedrigte Fetuin-A-Spiegel und zudem

meist ein erhöhtes Niveau an Kalzium x

Phosphat-Produkt aufweisen, kommen in

diesem Kollektiv gleich zwei Risikofaktoren

zum tragen. Um dieses Risikopotential besser

abschätzen zu können, haben wir einen

Assay (Nephelometrie) etabliert, um die

Fetuin-A-Serumspiegel zusammen mit dem

Hauptentzündungsparameter C-reaktives

Protein messen zu können.

Hinsichtlich der Vorhersage des Auftretens

von Kalzifikationsereignissen sind

bestimmte punktuelle Fetuin-A-Werte nur

eingeschränkt verwertbar. Das liegt zum

einen daran, daß Fetuin-A immer gemeinsam

mit anderen Auslösern der Kalzifikation

bewertet werden muß (z.B. dem Grad der

Inflammation, ausgedrückt in CRP-Werten,

oder dem Maß der Kalzium-Phosphat-Haushaltsstörung).

Zum anderen ist möglicherweise

nicht nur der absolute Fetuin-A-Wert

für das Verhindern der ektopen Kalzifikation

wichtig, sondern auch die Fähigkeit des

Individuums, bei Gefahr der Kalzifizierung

die Fetuin-A-Werte aufrechtzuerhalten.

In diesem Zusammenhang sind kürzlich

erschienene Arbeiten von Stenvinkel und

Mitarbeitern interessant. Sie zeigten, daß

Patienten mit dem 256Thr/Ser Fetuin-A

Allotyp 12 unter Inflammation mit dem Fetuin-A-Serumspiegel

„zusammenbrechen“.

Wir haben mittlerweile 10 Dialysepatienten

mit Kalziphylaxie (akute, schwere,

lebensbedrohliche arterioläre Obstruktionserkrankung

mit Kalziumphoshat-Ausfällung

vornehmlich im subkutanen Fett) im

zeitlichen Verlauf beobachtet, bei denen die

Fetuin-A-Werte überwiegend im (unteren)

Normbereich lagen. Diese Patienten zeigten

jedoch alle gleichzeitig erhöhte Inflammationsmarker

(CRP >20 mg/L). Fetuin-A ist

ein negatives Akutphase-Protein und möglicherweise

wird sich (delta) Fetuin-A als

relevanter Prädiktor von Kalzifikationsereignissen

erweisen. In einer Querschnittsanalyse

bei Nicht-Dialysepatienten korreliert das

Fetuin-A mit dem hochsensitiven CRP im

Normbereich oder leicht erhöhten Bereich

nur schlecht. Erst oberhalb von 20 mg/L CRP

sinken in Kohorten-Querschnittsanalysen

die mittleren Serumwerte von Fetuin-A

deutlich ab. (Abb. 5).

Ausblick

Mäuse mit Fetuin-Defizienz, die auf verschiedenen

genetischen Hintergründen

gezüchtet wurden, weisen unterschiedlich

starke Ausprägungen der Weichgewebskalzifizierung

auf 6 . Dies deutet auf wei-

Abb. 4: Fetuin-A-Serumkonzentration bei nierengesunden Probanden in Abhängigkeit vom Lebensalter

(Minimum, 25% Perzentile, Median, 75% Perzentile, Maximum)

14 | 6. Jahrgang | Nr. 6/2005 LABORWELT


Abb. 5: Fetuin-A-Serumkonzentration in Korrelation zum C-reaktiven Protein. In einem CRP-

Bereich


Molecular Imaging


Molekulare Bildgebung

von Gehirntumoren

B L I T Z L I C H T

Dr. Alexandra Winkeler, Dr. Lutz Kracht, Dr. Markus Klein, Parisa Monfared,

Dr. Yannic Waerzeggers und Prof. Dr. Andreas Jacobs,

Max Planck-Institut für neurologische Forschung, Zentrum für Molekulare Medizin (ZMMK)

und Klinik für Neurologie des Klinikums der Universität zu Köln

Molekulares Imaging beschreibt die nicht-invasive bildliche Darstellung biologischer Prozesse

in vivo mit Hilfe von Magnetresonanz-, Radionuklid- oder optisch basierten bildgebenden

Verfahren. In den vergangenen Jahren kam es zur Entwicklung verschiedener Reportersysteme,

mit deren Hilfe die Visualisierung und Analyse dynamischer Prozesse in vivo ermöglicht

wurde. Beispiele sind die endogene und exogene Genexpression, transkriptionelle Regulation

und Signaltransduktion. Unser Hauptanwendungsgebiet des molekularen Imaging ist

die Dokumentation des bildgesteuerten Therapieverlaufes bei malignen Gehirntumoren. Im

Mittelpunkt der gegenwärtigen Anstrengungen, um Therapie und Verlauf von Patienten mit

Glioblastom zu verbessern, stehen drei Forschungsschwerpunkte: die Darstellung der biologischen

Aktivität des Tumors mit Hilfe der Positronen-Emissions-Tomographie (PET; metabole

Charakterisierung); die Charakterisierung von PET-Markern, welche ein frühes Ansprechen

auf Chemo- und Gentherapie darstellen, sowie die Etablierung neuer biologischer Therapiestrategien

(Gentherapie). Wir setzen dabei multimodale Techniken ein, um die hohe räumliche

Auflösung der Magnetresonanztomographie (MRT), die hohe Sensitivität der PET sowie die

Möglichkeit der Verknüpfung mit zellbiologischen Verfahren in der optischen Bildgebung in

optimaler Weise zu kombinieren.

Key Words: Molecular Imaging, Positronen-Emissions-Tomographie, Gentherapie, Gehirntumore

Die nicht-invasive Lokalisierung und

Quantifizierung spezifischer molekularer

Prozesse, wie etwa die Expression zellulärer

Enzyme und Rezeptoren und die Aktivität

von Membrantransportern, läßt sich mit

Hilfe der Positronen-Emissions-Tomographie

(PET) erreichen. Dabei macht man

sich die Enzym-vermittelte Anreicherung,

Transporter-vermittelte Konzentrierung

beziehungsweise Rezeptor-vermittelte

Bindung radioaktiv markierter spezifischer

Substrate oder Bindungspartner zunutze 1 .

Unter Verwendung von zellulären Markern

wie etwa 11 C-Methionin (MET) oder 18 F-Fluoro-L-Thymidin

(FLT) ist es möglich, die

biologische Aktivität von Gehirntumoren

zu charakterisieren 2 . Auf der Basis von Berichten,

daß FLT ein Maß für die zelluläre

Thymidinkinaseaktivität und damit einen

Surrogatmarker für proliferative Aktivität

von Tumoren darstellt, wurden eine kinetische

Analyse sowie ein Vergleich mit dem

bereits etablierten Tracer 11 C-Methionin

durchgeführt. Dabei zeigte sich, daß die

Abb. 1: Parameter, die in der Diagnostik von Gliomen mittels bildgebender Verfahren (MRT/PET)

charakterisiert werden können. Biologisch aktive Tumoranteile eines Glioblastoms zeigen neben

einer Schrankenstörung im MRT einen relativ vermehrten Glukosestoffwechsel ( [18 F]FDG), eine

erhöhte Aminosäureaufnahme ([ 11 C]MET) und eine Anreicherung von Thymidin als Marker für

DNA-Replikation ([ 18 F]FLT) (aus [8]).

Sensitivität von FLT in der Diagnosestellung

insbesondere niedrigmaligner Gliome dem

MET unterlegen ist (78,3% vs. 91,3%). Allerdings

werden bei höhergradigen Gliomen

Tumorareale aufgezeigt, die mit Hilfe von

MRT und MET nicht darstellbar sind (Abb.

1). Mit Reportersystemen (Reportergen,

Abb. 2: Prinzip der nicht-invasiven Quantifizierung

von Genexpression mittels PET.

Die Genexpression der zellulären Thymidinkinase

(blau) und Vektor-vermittelter HSV-1-tk

(rot) kann durch Bestimmung der Akkumulationsrate,

K i [ml/min/g], von radioaktiv

markierten Nukleosidanaloga (NUC), wie etwa

[ 18 F]FLT, [ 124 I]FIAU und [ 18 F]FHBG, gemessen

werden. Dabei werden die Nukleosidanaloga

spezifisch durch die jeweilige Thymidinkinase

phosphoryliert, was zu ihrer Akkumulation in

der Zelle führt (aus [9]).

-probe) dagegen lassen sich Aussagen über

Ort, Dauer und Stärke der Genexpression

eines Reporters treffen. In Abhängigkeit

vom Promotor kommt es zur Expression des

Reportergens. Finden Genexpression und

Synthese des Reporters statt, so kommt es

zur Interaktion zwischen dem Reporter und

seinem Substrat und dabei zur Akkumulation

der Reporterprobe. Bei dieser Interaktion

kann es sich, wie schon für endogene Prozesse

beschrieben, um eine enzymatische

Reaktion zwischen einem Reporterenzym

und seinem Substrat oder um einen Rezeptor

und seinen Liganden handeln. Die Herpes-simplex-Virus-Typ1-Thymidinkinase

(HSV-1-tk) ist eines der am häufigsten genutzten

PET-Reportergene. HSV-1-TK ist in

der Lage, verschiedene, radioaktiv markierte

Purin- und Pyrimidinnukleosidanaloga zu

phosphorylieren. Dadurch kommt es in

Zellen, welche HSV-1-TK exprimieren, zur

Akkumulation von spezifisch radioaktiv

markierten Nukleosidanaloga wie etwa

124 I-FIAU oder 18 F-FHBG (Abb. 2), wobei

das Ausmaß der Akkumulation mit der

Stärke der Genexpression korreliert 3 . Mit

Hilfe dieses Reportersystems sind wir

Kennziffer 18 LW 06 · www.biocom.de �

16 | 6. Jahrgang | Nr. 6/2005 LABORWELT


in der Lage, die exogene Genexpression

sowie transkriptionelle Regulation und

Signaltransduktion darzustellen und zu

quantifizieren. Die Expression des Reporters

ist abhängig von der Wahl des jeweiligen

Promotors beziehungsweise Enhancer-

Elements, unter dessen Kontrolle sich das

Reportergen befindet. So kann zum Beispiel

B L I T Z L I C H T

die gewebespezifische Genexpression oder

Regulation untersucht werden. Beispiele dafür

sind die nicht-invasive Darstellung des

PET-Markergens HSV-1-tk unter Kontrolle

des Albuminpromotors 4 beziehungsweise

die transkriptionelle Regulation durch p53 5 .

In diesem Zusammenhang ist das nicht-invasive

Imaging des Transkriptionsfaktors

Abb. 3: Bildliche Darstellung von HSV-1-Amplikonvektor-vermittelter

Genexpression der

viralen Thymidinkinase (HSV-1-tk). Nacktmäusen

mit je zwei Gli36ΔEGFR-wt-Tumoren sowie

einem stabil Thymidinkinase-exprimierenden

Tumor (p.c. Gli36ΔEGRF-TG17) wurde der HSV-

Amplikonvektor HSV-TIG injiziert. Einer der

beiden wt-Tumore wurde so in vivo transduziert,

wohingegen der zweite als Negativkontrolle

(n.c.) fungierte (Mikrofotografie). In der transaxialen

bildlichen Darstellung der dazugehörigen

FHBG-PET-Aufnahme zeigt sich eine Akkumulation

des Radioaktivsignals zum einen in der

Positivkontrolle, zum anderen um die Injektionsstelle

des HSV-Amplikonvektors (aus [6]).

E2F1, dessen Expression in den meisten

Gliomen dereguliert ist, ein weiteres Forschungsprojekt

unserer Arbeitsgruppe.

Gentherapeutische Strategien

und begleitendes Imaging

In experimentellen Gentherapiestudien,

in welchen HSV-1-Amplikonvirione als

Vektoren zum Einschleusen der viralen

Thymidinkinase genutzt wurden, konnten

durch proportionale Koexpression eines therapeutischen

Gens indirekte Aussagen zur

Expression des Zweitgens getroffen werden 6 .

Dazu wurden HSV-1-Amplikonvektoren direkt

in subkutane Tumore (Gli36ΔEGFR) von

Nacktmäusen injiziert. Imaging der HSV-1-

TK erfolgte mittels FHBG-PET, dabei stellt

[ 18 F]FHBG (9-(4-[18F]fluoro-3-hydroxymethylbutyl)guanine)

das spezifische Substrat

der viralen Thymidinkinase dar (Abb. 3).

� Fortsetzung S. 21

Abb. 4: Die Regulation von Genexpression

wurde mit verschiedenen Techniken untersucht.

In Zellkultur wurden Gliomzellen mit

einem induzierbaren HSV-Amplikonvektor

infiziert, der das fluoreszierende Protein RFP

regulierbar exprimiert. Genexpression von rfp

wurde mittels Fluoreszenzmikroskopie in An-

und Abwesenheit des Regulators Doxyzyklin

untersucht. In Gegenwart von Doxyzyklin

konnten RFP-positive Zellen nachgewiesen

werden. In vivo konnte eine regulierbare Genexpression

von HSV-1-tk sowie firefly luciferase

durch nicht-invasives Imaging mit Hilfe

von [ 18 F]FHBG-PET und optischem Imaging

durch Biolumineszenz von Luciferase dargestellt

werden 10 .

18 | 6. Jahrgang | Nr. 6/2005 LABORWELT


Unter Verwendung dieser HSV-1-Amplikonvektoren,

welche therapeutische Gene und

PET-Markergene exprimieren, kann von der

PET-Markergenexpression indirekt auf die

Lokalisation und Stärke der therapeutischen

Genexpression geschlossen werden. Dabei

konnte die Transduktionseffizienz, gemessen

mittels FHBG-PET, mit dem induzierten

therapeutischen Effekt, gemessen mittels

FLT-PET, korreliert werden.

Imaging regulierbarer Genexpression

Als weiterer Schritt in der Gentherapie

wurden regulierbare HSV-1-Amplikonvektoren

etabliert, die es zulassen, die transduzierte

Genexpression von außen mittels

bestimmter Liganden (z.B. Doxyzyklin) zu

steuern 7 . Dieser Steuerungsmechanismus

wurde sowohl in Zellkultur (Fluoreszenz)

als auch in vivo durch PET-Imaging sowie

optischer Bildgebung (Biolumineszenz)

untersucht. Für das in vivo-Imaging mittels

Biolumineszenz wurde als Reporter das

Luciferasegen von Photinus pyralis (firefly

luciferase) verwendet. Unter Zugabe des

Substrates D-Luciferin kommt es in Zellen,

die das Luciferasegen exprimieren, zur

Emission von Licht, welches mit Hilfe einer

CCD-Kamera detektiert werden kann. Regulation

der Genexpression konnte in allen drei

verwendeten Methoden dargestellt werden

(Abb. 4). In Zukunft sollen diese Art von

Vektoren durch geeignete Kombination multimodaler

Imagingtechniken noch genauere

Kenntnisse über Ort, Dauer und Höhe der

Genexpression eines therapeutischen Gens

sowie den Verlauf von gentherapeutischen

Studien liefern.

Literatur

[1] Gambhir, S. S., Barrio, J. R., Herschman, H. R., and Phelps, M. E. (1999).

Nucl Med Biol 26: 481-490.

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[9] Jacobs, A., and Heiss, W. D. (2002). Vet Microbiol 86: 27-36.

[10] Winkeler, A., et al. (2005). submitted.

Korrespondenzadresse

Univ.-Prof. Dr. Andreas H. Jacobs

Laboratory for Gene Therapy and

Molecular Imaging

Max Planck Institute for

Neurological Research

Gleuelerstr. 50

D-50931 Köln

Tel.: +49-221-4726-219

Fax: +49-221-4726-298

eMail: Andreas.Jacobs@pet.mpin-koeln.

mpg.de

B L I T Z L I C H T

Diagnostische Peptide


Spezifische Darstellung

und Therapie von

Krebserkrankungen

Dr. Sabine Zitzmann, Research Laboratories, Schering AG, Berlin;

Eva-Maria Knapp, Klinische Kooperationseinheit Nuklearmedizin, DKFZ, Heidelberg;

Priv.-Doz. Dr. Walter Mier, Nuklearmedizin, Ruprecht-Karls-Universität, Heidelberg

Als diagnostische Peptide werden kleine Moleküle verwendet, die aus 5 bis 15 Aminosäuren

bestehen. Sie binden an spezifische Rezeptoren, die auf der Oberfläche von Tumorzellen

überexprimiert werden und reichern sich so im Tumor an. Wenn diese diagnostischen Peptide

zum Beispiel radioaktiv markiert werden, kann die Anreicherung durch bildgebende Verfahren

dargestellt und der Tumor und seine Tochtergeschwülste genau lokalisiert werden. Darüber

hinaus erlaubt die zusätzliche Information über die Rezeptordichte eine Einschätzung des

möglichen Erfolges einer Peptid-Radiotherapie. Neben der Weiterentwicklung natürlicher

Peptide ist die Suche nach neuen Tumor-affinen Peptiden ein wichtiger Schritt in die Richtung

der gezielten bildgebenden Tumordarstellung und Tumortherapie.

Key Words: Tumor imaging, diagnostische Peptide, Octreotid, Phagendisplay, Peptid-

Tumortherapie

In der aktuellen Todesursachen-Statistik

rangieren Krebserkrankungen an zweiter

Stelle hinter den Herz-Kreislauferkrankungen.

Heute ist jeder vierte Todesfall auf eine

Krebserkrankung zurückzuführen. Längst ist

Krebs nicht mehr nur Krebs, sondern wird

nach Entstehungsort und nach seinen spezifischen

Eigenschaften unterschieden, was

Auswirkungen auf die Prognose und Therapie

der Erkrankung hat. Für die Diagnose der

Krebserkrankung stehen verschiedene bildgebende

Verfahren zur Auswahl. Die wohl

bekannteste Möglichkeit ist die Computer-Tomographie

(CT). Es handelt sich hier um eine

rein anatomische Darstellung von Körperteilen,

bei der Röntgenstrahlung auf den Körper

trifft und von den verschiedenen Gewebearten

unterschiedlich stark abgeschwächt wird. Eine

weitere anatomische Bildgebungsmodalität ist

die Magnet-Resonanz-Tomographie (MRT),

auch als Kernspin-Tomographie bekannt. Hier

wird in einem starken Magnetfeld die Resonanz

der im Körper befindlichen Wasserstoffatome

gemessen. Das Verfahren ergibt ein

sehr genaues und differenziertes Bild aller

Körpergewebe. Vor allem nicht-knöcherne

Strukturen wie Weichteile, Organe, Gelenke,

und das Gehirn können mit hinreichend

guter Auflösung abgebildet werden. Die Positronen-Emissionstomographie

(PET) stellt

ein weiteres bildgebendes Verfahren dar, das

sich durch die Möglichkeit der Darstellung

von Stoffwechselabläufen im untersuchten

Körper auszeichnet. Bei der PET werden

Radiopharmaka (auch Tracer genannt) eingesetzt.

Radiopharmaka sind Substanzen, die

mit einem Radionuklid markiert sind. Gängige

Radionuklide sind: 18 F, 11 C, 13 N, 15 O (es handelt

sich dabei um die Positronen-emittierenden

radioaktiven Isotope der Elemente Fluor,

Kohlenstoff, Stickstoff oder Sauerstoff) oder

auch 62 Cu oder 68 Ga. Mit diesen radioaktiven

Tab. 1: Auswahl von natürlichen Peptiden, die für das Tumorimaging eingesetzt werden können

Ligand Tumortyp-Selektivität

Somatostatin Neuroendokrine Tumoren, Nonhodkgin-Lymphome, Melanome,

Brusttumoren

alpha-MSH Melanome

LHRH Prostatatumoren, Brusttumoren

VIP/PACAP SCLC, Kolontumoren, Magentumoren, Pankreastumoren

RGD Blutgefäße von Tumoren

CCK-B/Gastrin MTC, SCLC, Pankreastumoren, Astrocytome, stromaler Eierstockkrebs

Neurotensin SCLC, Kolontumoren, exokrine Pankreastumoren

Bombesin/GRP SCLC, Kolontumoren, Glioblastome, Prostatatumoren

Substanz P Glioblastome, Astrocytome, MTC, Brusttumoren, peritoneale Blutgefäße

LABORWELT 6. Jahrgang | Nr. 6/2005 | 21


B L I T Z L I C H T

Abb. 1: links: Positronen-Emissionstomographische (PET)-Untersuchung eines Patienten mit

fortschreitenden multiplen Lymphknotenmetastasen eines neuroendokrinen Pankreaskopf-

Tumors nach Injektion von 68 Ga-DOTATOC. rechts: Schematische Darstellung der chemischen

Struktur des 68 Ga-DOTATOC. Um das Potential des Targetings für die Therapie zu nutzen, kann

DOTATOC anstelle von 68 Ga mit cytotoxischen Radionukliden wie 177 Lu oder 90 Y für die Endoradiotherapie

eingesetzt werden.

Isotopen lassen sich Moleküle herstellen, die

der Organismus nicht von ihren nichtradioaktiven

Pendants unterscheiden kann oder

die natürlichen Stoffen chemisch zumindest

ähneln (Abb. 1). Da die Detektoren für die

Radiotracer sehr empfindlich sind, erhält der

Patient nur eine geringe Strahlenbelastung,

welche die Dosiswerte im Vergleich zum CT

in der Regel unterschreitet.

Natürliche tumoraffine Peptide

Eine Weiterentwicklung der tumorspezifischen

bildgebenden Darstellung wurde durch

Abb. 2: oben: Elektronenmikroskopische Aufnahme eines filamentösen Phagen, wie er für das

Peptid-Phagendisplay verwendet wird. Daneben eine schematische Darstellung eines Phagen mit

den für die Peptid-Präsentation wichtigen Bestandteilen. unten: Zusammenfassung des in mehreren

Zyklen durchlaufenen Selektionsprozesses, bei dem aus einer großen Anzahl verschiedener

Peptid-tragender Phagen, jene mit spezifisch bindenden Peptidmotiven angereichert werden.

die Erkenntnis möglich, daß sich Tumoren in

Abhängigkeit von ihrem Ursprung aufgrund

spezifischer Peptidrezeptoren vom restlichen

Gewebe unterscheiden. Peptide haben, im

Vergleich zu größeren Molekülen wie etwa

Antikörpern, entscheidende Vorteile. Da Peptide

deutlich kleiner sind, gelangen sie schneller

und ohne sterische Behinderungen an ihr Ziel.

Sie werden meist schnell wieder ausgeschieden

und erlauben so einen guten Kontrast

zwischen Tumor und umgebenden Gewebe.

Auch verursachen Peptide keine Immunantwort

im Körper, wodurch aufwendige Humanisierungsversuche

entfallen. Zudem kann die

Herstellung relativ schnell und kostengünstig

durch chemische Synthese erfolgen. Ein

Beispiel für ein natürliches tumorspezifische

Peptid und dessen Rezeptor ist das Vasoaktive

Intestinale Poly-Peptid (VIP). Die Rezeptoren

für VIP werden in neuroendokrinen Tumoren

sowie vielen anderen Tumoren (Adenokarzinome,

Lymphome, Astrocytome, Glioblastome

und Meningiome) überexprimiert 1 .

Somatostatin-Rezeptoren (SSTR) stellen eine

weitere Gruppe von Rezeptoren dar, die auf

der Mehrzahl aller neuroendokrinen Tumoren 2

und Neuroblastomen, einigen medullären

Schilddrüsenkarzinomen, Prostatatumoren,

Phäochromozytomen und kleinzelligen

Lungentumoren exprimiert werden. Um ein

Peptid für ein Tumorimaging oder die Tumortherapie

verwenden zu können, sind folgende

Punkte wichtig: Zunächst muß der Rezeptor,

an den das Peptid bindet, im Tumor in sehr

viel größerer Anzahl vorhanden sein als im

übrigen Körper. Das Peptid sollte stabil sein

und nicht oder nur langsam im Blut abgebaut

werden. Des weiteren ist eine ausreichende

Affinität und die Möglichkeit, das Peptid zu

markieren, ohne daß es seine Bindungseigenschaften

verliert, notwendig.

Tumorimaging mit Octreotid

Somatostatin war eines der ersten Peptide,

welche auf ihr Potential zur Darstellung rezeptorüberexprimierender

Tumoren getestet

wurde. Das natürliche Somatostatin wird

im Körper rasch enzymatisch abgebaut. Aus

diesem Grund wurden modifizierte Derivate

des Somatostatins synthetisiert, mit denen in

vivo eine deutlich verlängerte physiologische

Halbwertszeit erreicht werden kann. Das erfolgreichste

ist das bereits seit 1982 bekannte

Octreotid (Sandostatin ® ) 3 . Hierzu wurde das

14 Aminosäuren lange, zyklische Somatostatin

auf acht Aminosäuren verkürzt und N-terminal

mit dem Chelator Diethylentriaminpentaessigsäure

(DTPA) zum DTPA-Phe 1 -Octreotid

konjugiert, um eine effiziente Markierung

mit 111 In zu ermöglichen. 111 In-DTPA-Phe 1 -

Octreotid ist mittlerweile ein registriertes

Radiopharmakon für die Verlaufskontrolle

von Patienten mit neuroendokrinen Tumoren 4 .

Die Darstellung mit 111 In-DTPA-Phe 1 -Octreotid

ist insbesondere auch bei Patienten mit Brust-

22 | 6. Jahrgang | Nr. 6/2005 LABORWELT


karzinomen und Lymphomen erfolgreich.

Aber die Darstellung von Tumoren mit Hilfe

von Octreotid ist natürlich nur für die Tumore

möglich, die den Somatostatin-Rezeptor

exprimieren.

Suche nach tumorspezifischen Peptiden

Um das Spektrum auch auf andere Tumoren

auszuweiten, gibt es Forschungsbemühungen,

neue Tumor-spezifische Peptide zu

identifizieren. Ein Ansatz für die Suche nach

weiteren Tumor-affinen Peptiden ist das

Peptid-Phagendisplay.

Das Phagen-Display ist eine leistungsfähige

Technologie, um neue Polypeptide für die

Anwendungen in der Biotechnologie und der

Medizin zu identifizieren. Das Prinzip, daß

Peptide auf der Oberfläche von filamentösen

Bakteriophagen präsentiert werden können,

wurde erstmals von Smith in den achtziger

Jahren beschrieben 5 . In den Phagenbibliotheken

kann eine Vielzahl unterschiedlicher

Peptide auf den Phagen exprimiert werden.

Die Population der an die Zielstruktur

bindenden Klone kann mittels rationaler

Selektionstechniken angereichert werden und

so Moleküle mit der gewünschten Spezifität

für die ausgewählte Zielstruktur identifiziert

werden.

Der Prozeß des Phagen-Displays beginnt

mit der Herstellung einer großen Anzahl von

Peptid-tragenden Phagen („Bibliothek“). Der

Umfang einer solchen Phagenbibliothek kann

im Idealfall bis zu 10 12 verschiedene Motive

umfassen. Phagen, die spezifisch bindende

Liganden tragen, können durch eine Serie

von Selektionszyklen isoliert werden.

Der Prozeß beginnt mit der Bindung der

Phagen an das Zielmolekül, einem anschließenden

Waschschritt, um ungebundene Phagen

zu entfernen, und endet mit der Elution

der gebundenen Phagen. Als nächster Schritt

erfolgt die Reamplifikation der spezifisch

gebundenen Phagen in Bakterien. Dieser

Selektionsvorgang kann mehrmals wiederholt

werden, bis eine Population der „besten

Binder“ isoliert wird. Von diesen „Bindern“

wird das Genom isoliert und daraus die

Sequenz des affinen Peptides ermittelt. Anschließend

kann das Insert als synthetisches

Peptid reproduziert werden. Die Selektion

der Phagen kann sowohl in vitro, also in der

Zellkultur 6 oder mit isolierten Proteinen,

als auch in vivo, beispielsweise in Mäusen 7 ,

erfolgen (Abb. 2).

Mittels solcher Selektionsschritte konnte

zum Beispiel ein Peptid isoliert werden,

welches spezifisch an Prostatatumorzellen

bindet 8 . Neben dieser selektiven Bindung

und Internalisierung zeigt das Peptid auch

eine gute Anreicherung im Tiermodell.

Allerdings wird dieses prostataspezifische

Peptid im Serum des Menschen schnell

abgebaut, weshalb zunächst Anstrengungen

unternommen werden müssen, es zu

B L I T Z L I C H T

stabilisieren, bevor es für einen Einsatz im

klinischen Bereich geeignet ist.

Neben der diagnostischen Darstellung der

Tumoren erlaubt der Einsatz Partikel-emittierender

Radioisotope auch eine gezielte

Therapie mit tumorspezifischen Peptiden.

Die erfolgreiche bildliche Darstellung neuroendokriner

Tumoren mit Octreotidderivaten

stimulierte die Entwicklung markierter Octreotid-Analoga

für therapeutische Anwendungen.

Die Erprobung von 90Y-DOTA0-

D-Phe1-Tyr3-Octreotid (DOTATOC) wird

derzeit in mehreren klinischen Zentren

durchgeführt. In einer Studie wurde zunächst

eine darstellende Untersuchung mit

111 In-DTPA-Phe1-Octreotid durchgeführt, um

individuelle dosimetrische Abschätzungen

zu ermöglichen, bevor 90Y-DOTATOC zur

Therapie appliziert wurde. Dadurch konnte

nach rund 12 Monaten bei 27% der Patienten

eine Reduktion des Tumorvolumens und bei

64% ein stabiler Krankheitsverlauf erzielt

werden. Bei 13% der Patienten wurde eine

Progression beobachtet 9 . Die Berücksichtigung

der Tatsache, daß dieses Patientenkollektiv

aus bis dahin erfolglos behandelten

Patienten besteht, unterstreicht den enormen

Wert dieses Vorgehens.

Ausblick

Im Zuge eines immer besseren Verständnisses

der molekularen Mechanismen von Krebs,

werden zunehmend krankheitsrelevante Erkenntnisse

in die Klinik und die Patientenbehandlung

übertragen. Die Verwendung von

tumorspezifischen Peptiden zur Darstellung

von Tumoren und Metastasen eröffnet ein

neues weites Spektrum von Anwendungen

im klinischen Bereich. Wie sich am Beispiel

der Somatostatin-Peptidderivate zeigt, kann

eine gezielte Anreicherung von Peptiden

im Tumor zu einer guten Darstellung der

Krebserkrankung und in einigen Fällen für

eine verbesserte und zielgerichtete Therapie

sorgen. Durch die Erforschung der schon

vorhandenen Peptide und die Suche nach

neuen tumorspezifischen Peptiden bietet sich

vielleicht bald die Möglichkeit, Krebserkrankungen

frühzeitig zu diagnostizieren, den Patienten

nichtinvasiv auf Tumoreigenschaften

zu untersuchen und effizientere Therapeutika

anzuwenden.

Literatur

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Wiedenmann, B. Eur J Nucl Med 27(2000), 1684-1693.

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Korrespondenzadresse

Dr. Sabine Zitzmann

Radiopharmaceuticals Research

Schering AG, Berlin

Tel.: +49-(0)30-468-11427

Fax: +49-(0)30-468-16609

eMail: sabine.zitzmann@schering.de

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LABORWELT 6. Jahrgang | Nr. 6/2005 | 23


Proteomics


W I S S E N S C H A F T

Präparative Aufreinigung von

Organellen mit Immuno-FFE

Markus Islinger 1 , Heribert Mohr 1 , Alfred Völkl 1 , Anatomie und Zellbiologie,

Universität Heidelberg; Gerhard Weber, Christoph Eckerskorn; BD Diagnostics, Martinsried

Als trägerfreie Separationstechnik unter kontinuierlichem Durchfluß bietet die Free-Flow-

Elektrophorese (FFE) ein breites Applikationsspektrum bei der Trennung von biologischem

Probenmaterial wie Peptiden, Proteinen, Proteinkomplexen bis zu vollständigen, intakten

Zellorganellen. Hierbei spielt vor allem die hohe Modularität des Systems hinsichtlich der

verwendeten Trennprinzipien eine ausschlaggebende Rolle: So bieten sich Zonenelektrophorese,

isoelektrische Fokussierung oder Isotachophorese als separierendes Prinzip an. Darüber

hinaus besteht jedoch die Möglichkeit, die hohe Affinität von Antigen-Antikörper-Reaktionen

für die Isolierung von Einzelsubstanzen aus komplexen biologischen Gemischen zu nutzen.

Diesbezüglich stellt die Technik der Immuno-Free-Flow-Elektrophorese eine effektive Methode

dar, intakte Organellen aus Zellhomogenaten zu isolieren, die – wenn überhaupt – sonst nur

durch aufwendige Zentrifugationsverfahren anzureichern sind.

Die überraschend niedrige Anzahl von Genen

in den Genomen höherer Organismen legt ein

komplexes Regulationswerk auf der Ebene

der Proteinexpression innerhalb einer Zelle

nahe, das eine Gesamtanzahl von mehreren

hunderttausend Proteinspezies erwarten

läßt. In dieser Hinsicht steht die Proteomforschung

vor der Aufgabe, nicht nur die

Gesamtheit der in einem Organismus auftretenden

Genprodukte zu erfassen, sondern

auch zwischen funktionell unterschiedlichen

Spleißvarianten und posttranlationalen Modifikationen,

wie Phosphorylierungen und

Glycosylierungen zu unterscheiden. Die zunehmende

Automatisierung der massenspektrometrischen

Proteinanalytik erlaubt es zwar

mittlerweile, Proteine in hohem Durchsatz zu

identifizieren und zu quantifizieren, jedoch

erfordert der hohe dynamische Bereich in der

Abundanz unterschiedlicher Proteine meist

eine vorangehende Probenfraktionierung,

um auch gering vertretene, aber potentiell

physiologisch bedeutende Proteine zu erfassen.

Diesbezüglich bietet die Isolierung

von Organellen die Möglichkeit, Zellen nicht

nur effektiv zu fraktionieren, sondern auch

identifizierte Proteine einer für das Organell

spezifischen Aufgabe zuzuordnen und so

erste Hinweise auf die Funktion bisher noch

unbekannter Proteine zu gewinnen.

Meist werden Organellen auf klassische

Weise über mehrere differentielle Zentrifugationsschritte

und/oder Dichtegradientenzentrifugation

gewonnen. Jedoch führen

diese Verfahren häufig zu Materialverlusten

und -veränderungen aufgrund der hohen

mechanischen Belastungen während des

Trennprozesses. Darüber hinaus erlauben sie

keine befriedigende Isolierung von Organellpopulationen

mit ähnlicher Dichte. Als kon-

Abb. 1: BD Free Flow

Electrophoresis-

System

Abb. 2: a) Abtrennung eines peroxisomalen

Peaks von der Hauptmasse der Organellen.

Die IFFE wurde mit einer D-Fraktion der Rattenleber

nach vorheriger Inkubation mit peroxisomalem

Membranantikörper (anti-PMP70)

durchgeführt. b) Negativkontrolle einer Zonen-

FFE ohne vorherige Antikörperinkubation, Es

treten zwar Anreicherungen auf, jedoch keine

deutlich voneinander getrennten Einzelpeaks.

Die Farben verdeutlichen Fraktionen mit überwiegender

Anreicherung folgender Organellen

im Trennprofil: gelb – Mikrosomen, grün –

Mitochondrien, rot – Peroxisomen.

tinuierliches, rein auf flüssigen Trennphasen

basierendes Verfahren stellt die Free-Flow-

Elektrophorese (FFE) in beiderlei Hinsicht

eine Alternative zu herkömmlichen Trennmethoden

dar. Sie arbeitet nach dem Prinzip

einer trägerfreien Elektrophorese, bei der

der Trennprozeß in Abwesenheit einer festen

Matrix stattfindet, wie beispielsweise Acrylamid

in der Gelelektrophorese. Statt dessen

werden Analyte in einem kontinuierlichen

laminaren Fluß von Pufferlösungen durch ein

dazu senkrecht angelegtes elektrisches Feld

entsprechend ihrer Ladung und Mobilität

aufgetrennt (Abb. 1). In den vergangenen

Jahren konnten in der Tat unterschiedliche

Zellorganellen wie Mitochondrien 1 , Melanosomen

2 , sekretorische Vesikel 3 oder Endosomen

4 über klassische Zonenelektrophorese

gereinigt werden. Aufgrund der teilweise

hohen Ladungsheterogenität von Zellorganellen

und ihrer Ähnlichkeit in anderen

physikalischen Eigenschaften bleiben solche

Fraktionen abhängig vom Ausgangsgewebe

jedoch häufig weiterhin mit anderen Organellpopulationen

verunreinigt. Antigen-An-

Kennziffer 20 LW 06 · www.biocom.de �

24 | 6. Jahrgang | Nr. 6/2005 LABORWELT


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W I S S E N S C H A F T

Abb. 3: a. SDS-PAGE von Peroxisomen nach Isolierung über Immuno-FFE (2) oder Dichtegradientenzentrifugation

(3) im Vergleich zur Ausgangsfraktion (1). b. Immunoblotanalyse der durch

Immuno-FFE isolierten Peroxisomen. Zum Nachweis der Peroxisomen wurden polyklonale

Antikörper gegen Acyl-CoA-Oxidase (AOx), Uratoxidase (UOx) und PMP22 verwendet. Mitochondrien

wurden mir einem Antiserum gegen ein nicht weiter charakterisiertes mitochondriales

Membranprotein detektiert. Ausgangsfraktion (D-Fraktion, A), Vereinigte Fraktionen 22-25 der

IFFE (B), vereinigte Fraktionen 31-35 der IFFE (C). c- Immunelektronenmikroskopie der IFFE-isolierten

Peroxisomen mit Katalaseantikörper. Die einzelnen Organellen sind von einer durchgehenden

Membran umgeben und weisen in ihrer Matrix hohe Konzentrationen von Katalase auf.

tikörperinteraktionen bieten die Möglichkeit,

Proteine mit hoher Affinität zu binden und

somit Einzelproteine hochspezifisch aus Proteingemischen

über Affinitäts-Chromatographie

zu isolieren. Während sich die herkömmliche

Affinität-Chromatographie aufgrund der

hohen auftretenden Scherkräfte nicht zur

Aufreinigung intakter Organellen eignet,

stellt die Immuno-Free-Flow-Elektrophorese

(IFFE) diesbezüglich durch die in flüssiger

Phase stattfindende Trennung ein schonendes

und effektives Alternativverfahren für die

Isolierung von Organellen dar. Aufgrund ihres

nahezu identischen pIs sind Antikörper im

elektrischen Feld bei einem pH 8,0 weitgehend

unbeweglich, da sie nahezu keine Nettoladung

besitzen, und lassen sich daher als scharf geschnittener

homogener Peak nahe der Anode

der FFE-Trennkammer fokussieren. Folglich

bewirkt der Antikörper-pI nach Kopplung

an spezifische Oberflächenmoleküle eines

Organells eine drastische Veränderung des

Masse/Ladungsverhältnisses und somit eine

deutlich verminderte Mobilität im elektrischen

Feld der FFE. Dies führt zu einer Ablenkung

der Antikörper-gekoppelten Organellen aus

der Hauptmasse des Partikelstroms.

Applikation

Zur Etablierung und Validierung dieses

Verfahrens wurden Rattenleber-Peroxisomen

aus einem grob vorgereinigten Leberhomogenat

(D-Fraktion 5 ) aufgereinigt und

mit der Reinheit von herkömmlich durch

Dichtgradientenzentrifugation isolierten

Peroxisomen verglichen 6 . Zur Kopplung an

die Peroxisomen wurden D-Fraktion und ein

polyklonaler PMP70-Antikörper (peroxisomal

membrane protein of 70 kDa) für eine Stunde

bei Raumtemperatur inkubiert. Durch Zentrifugation

wurden die Organellen anschließend

von überschüssigem Antikörper getrennt

und in Puffer für die IFFE resuspendiert. Zur

Auftrennung wurde die Organellsuspension

fortlaufend in die Trennkammer eingebracht,

unter zonenelektrophoretischen Bedingungen

getrennt und kontinuierlich in 96 Fraktionen

auf Mikrotiterplatten gesammelt. Wie in

Abbildung 2a anhand des Absorptionsspektrums

bei 280 nm dargestellt, wandern die

mit Antikörper beladenen Peroxisomen durch

die verringerte Ladungsdichte im elektrischen

Feld deutlich verlangsamt und werden dadurch

als Seitenpeak deutlich vom Hauptpeak

der Mitochondrien abgetrennt. Ein Vergleich

mit einer ohne vorherige Antikörperbeladung

durchgeführten FFE (Abb. 2b) verdeutlicht

das Potential der Methode. Um die Reinheit

der mittels IFFE isolierten Peroxisomen zu

beurteilen, wurden das bei der SDS-PAGE

erhaltene Proteinmuster mit dem von Peroxisomen

verglichen, die mit herkömmlicher

Dichtegradientenzentrifugation isoliert wurden.

Wie in Abbildung 3a gezeigt, stimmen

beide Bandenmuster fast vollständig überein,

unterscheiden sich aber signifikant von der für

beide Separationstechniken verwendeten Ausgangsfraktionen.

Auch im Immunoblot (Abb.

3b) verdeutlichen die peroxisomalen Markerproteine

Acyl-CoA-Oxidase, Uratoxidase und

PMP22 die fast quantitative Aufreinigung der

Peroxisomen im Seitenpeak des Trennprofils.

Dagegen überwiegen in der Ausgangsprobe

(D-Pellet) Mitochondrien (MMP), die überwiegend

im Hauptpeak des Trennprofils angereichert

werden. Die Intaktheit der isolierten

Organellen demonstrieren die in Abbildung

3c dargestellten elektronenmikroskopischen

Schnitte. Die über IFFE isolierten Peroxisomen

sind von einer kontinuierlichen, gut erhaltenen

Membran umgeben. Die Immunmarkierung

mit Goldpartikeln gegen das peroxisomale

Matrixenzym Katalase zeigt eine intensive

Markierung des Organellinneren, während

nur wenige Partikel außerhalb zu finden sind,

so daß von nur geringen Verlusten während

der Homogenisation und Isolierung der Organellen

auszugehen ist.

Wie in dieser Arbeit gezeigt, eignet sich

die Methode der Immuno-Free-Flow-Elektrophorese

zur Gewinnung hochreiner Organellfraktionen

von hoher Qualität, die folglich

direkt zur nachfolgenden Proteomanalyse

verwendet werden können. Die Beschränkung

der Methode ist natürlich durch die

Verfügbarkeit relativ großer Antikörpermengen

vorgegeben, die die Verwendung von in

großen Mengen, mit gleichbleibender Qualität

produzierbarer monoklonaler Antikörper

voraussetzen.

Die eindeutige Stärke der Methode liegt

jedoch in ihrem Potential, auch physikalisch

sehr ähnliche Zellkompartimente voneinander

trennen zu können 7,8 . Bei Verfügbarkeit

geeigneter Antikörper verspricht die IFFE

besonders im Bereich äußerst heterogener

Organellpopulationen, wie etwa synaptischer

Vesikel oder Mikrosomen, eine Auftrennung

in analysierbare, klar voneinander abzugrenzende

Subfraktionen, die einen wertvollen

Beitrag zum Verständnis biologisch komplexer

Zellstrukturen leisten kann.

Literatur

[1] Zischka, H., G. Weber et al. (2003). “Improved proteome analysis of Saccharomyces

cerevisae mitochondria by free-flow electrophoresis.” Proteomics

3: 906-16

[2] Kushimoto, T., V., Basrur (2001) “A model for melanosome biogenesis based

on the purification and analysis of early melanosomes” Proc Natl Acad Sci U

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[3] Sengelov, H., Borregard, N. (1999) “Free-flow electrophoresis in subcellular

fractionation of human neutrophils.” J. Immunol. Methods 232: 145-52.

[4] Schober, D., P. Kronrnberger (1998) “Major and minor receptor group human

rhinoviruses penetrate from endosomes by different mechanisms. ” J Virol.

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[5] Völkl, A., H.D. Fahimi (1985). “Isolation and characterization of peroxisomes

from the liver of normal and untreated rats.” Eur. J. Biochem. 149: 257-65.

[6] Völkl, A. H. Mohr et al. (1997). “Isolation of rat hepatic peroxiomes by means

of immune free flow electrophoresis.” Electrophoresis 18: 774-80.

[7] Völkl A., H. Mohr et al. (1998) “Isolation of peroxisome subpopulations from

rat liver by means of free-flow electrophoresis.” Electrophoresis 19: 1140-4.

[8] Mohr, H., A. Völkl (2002) “Isolation of peroxisomal subpopulations from

mouse liver by immune free-flow electrophoresis.” Electrophoresis 23:

2130-7.

Korrespondenzadressen

Dr. Markus Islinger

Institut für Anatomie und Zellbiologie II

Universität Heidelberg

Im Neuenheimer Feld 307

D-69120 Heidelberg

Markus.Islinger@urz.uni-heidelberg.de

PD Dr. Christoph Eckerskorn

BD Diagnostics, Preanalytical Systems

Im Innovationszentrum Biotechnologie

D-82152 Martinsried

Christoph_Eckerskorn@europe.bd.com

26 | 6. Jahrgang | Nr. 6/2005 LABORWELT


HD-Microarrays


Association studies

of complex diseases

B L I T Z L I C H T

Greg Yap, Vice President, DNA Products, Affymetrix Inc., Santa Clara, USA

Starting in the 1990s, a genome sequencing revolution began that propelled research into the

modern genetic era. Inexpensive, reliable, and automated DNA sequencing methods enabled

scientists to sequence the complete genomes of organisms ranging from lower bacteria and

viruses to higher plants, animals and humans. In the aftermath of this flood of information, we

are now faced with the far more daunting task of determining how knowledge of billions of

nucleotide bases can be put to practical use to improve human health and treat disease.

High-density microarray technology, invented

by Stephen P.A. Fodor and colleagues 1-3 , enables

scientists to sift through enormous genome

sequences and identify important biological

information. Microarrays opened up an entire

new world to researchers, and have now given

scientists the ability to analyze gene expression

for the complete coding content of the human

genome in a single experiment. This objective

analysis method has helped scientists to discover

the genetic pathways disrupted in diseases

ranging from cancer to multiple sclerosis, and

has enabled them to more accurately stratify

disease, predict patient outcome, and make

better therapeutic choices.

Now, the most recent generation of microarrays

empower scientists to quickly genotype

10,000, 100,000 or even 500,000 SNPs distributed

across the human genome, enabling

them to conduct previously impossible genetic

association studies of complex disease and

drug response. Similarly, researchers are also

using high-density microarrays for targeted

genotyping studies of more than 10,000 SNPs.

These new tools for disease mapping studies

4-8 , deliver the most markers and highest

resolutions available, and have already helped

pinpointing genes linked to diseases such

as sudden infant death syndrome 6 , neonatal

diabetes 7 , and macular degeneration 9 .

Manufacturing

SIE HABEN EIN STARKES PRODUKT AN DEN

START GEBRACHT – LSC FÜHRT ES INS ZIEL.

The first step in creating a microarray suitable

for genome-wide analysis, required developing

a scalable manufacturing technology 1 .

GeneChip microarrays are a classic Silicon

Valley innovation, combining several disciplines

to create a new technology and more

useful research tool. The integration of semi-

Kennziffer 21 LW 06 · Informationen ordern? · www.biocom.de

conductor fabrication techniques, solid-phase

chemistry, random access combinatorial chemistry,

molecular biology, and sophisticated robotics

resulted in a unique photolithographic

manufacturing process capable of producing

high-density microarrays with millions of

probes on a single glass chip.

The photolithographic process begins by

coating a 5” x 5” wafer with a light-sensitive

chemical compound (i.e. protecting groups)

that prevents coupling between the glass

and the first nucleotide of the DNA probe

being created. Lithographic masks are used

to either block or transmit light onto specific

locations of the glass surface. The surface is

then covered with a solution containing either

adenine, thymine, cytosine or guanine, and

coupling occurs only at those locations on

the glass that have been deprotected through

illumination. The coupled nucleotide itselve

also bears a light-sensitive protecting group,

so the cycle can be repeated. In this way, the

microarray is built as the probes are synthesized

through repeated cycles of combinatorial

chemistry – where combinations of probes are

simultaneously synthesized. Commercially

available arrays are manufactured at a density

of nearly 300 million probes per wafer. But,

depending on the demands of the experiment

and the number of probes required per array,

each wafer can be divided into hundreds of

individual arrays. A sampling of arrays from

every wafer is then used to test the entire lot

by running control hybridizations.

Combinatoric theory holds that the number

of compounds of length N, composed of Y

different subunits, is equal to Y N , and one

can synthesize each of Y N compounds in Y

times N steps. Applying this theory to the

genome, 25-mer probes are created by using

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6. Jahrgang | Nr. 6/2005 | 27


four nucleotides, A, C, T and G, enabling the

synthesis of roughly 10 15 probes in 4 times 25,

or 100 steps. In this way, it’s possible to make

an array of virtually any size – including arrays

that can examine the entire 3.1 billion bases

in the human genome – in 100 steps or less.

By reducing array feature size, more probes

can be packaged onto the same size surface,

increasing the genetic processing power of

each individual array. For instance, the first

commercial GeneChip products shipped in

1994 had a feature size of 100 microns, that by

2005 have been reduced to 5 microns, allowing

400 times more content on each array.

The high data capacity offered by photolithographic

manufacturing techniques has

provided scientists with tools to study up to

500,000 SNP genotypes per sample analyzed.

For any given SNP of two possible genotypes,

A or B, probes are synthesized on the array

corresponding to both alleles. Following hybridization

of the target to the array, scientists

can then determine whether a SNP is an AA,

AB, or BB genotype by simply analyzing

whether the A allele probes have detected

their complementary sequence, or whether

the B allele probes have detected their complementary

sequence, or whether both have

detected complementary sequences.

500K: Probe set strategy

Every SNP genotype represented on a genotyping

microarray is measured through a

perfect match probe, as well as a mismatch

probe. The mismatch probe serves as an internal

control, accounting for spurious signals

and cross-hybridization. Each probe-pair is

the basic unit used to call a SNP genotype.

However, to ensure highly accurate genotype

calls, GeneChip arrays routinely use multiple

probe pairs to call the genotype for each SNP

represented on the array (Fig. 1).

The first probe pair contains the SNP precisely

in the center of the 25mer sequence. The

remaining probe pairs are positioned, or tiled,

to the right and the left of this central position.

B L I T Z L I C H T

This strategy is used to genotype the A and B

allele of every SNP from both sense and antisense

strands of DNA. The need for high-density

manufacturing technique quickly makes

itself obvious when genotyping large number

of SNPs – more than 10 million probes are used

to genotype the 500,000 SNPs represented on

the Human Mapping 500K Array Set.

500K: Assay

The key to array-based SNP genotyping demanded

an assay that would not require allele

specific amplifications. And much the way a

single assay is used to prepare all transcripts

for whole-genome expression analysis, Affymetrix

developed a whole genome sampling

assay (WGSA) that uses only one primer to

genotype hundreds of thousands of SNPs

distributed throughout the genome 10 . Previous

SNP mapping efforts have been hampered by

the need for locus-specific amplification and

the need for many tens of thousands of PCR

amplifications – an expensive and cumbersome

undertaking.

The WGSA method uses a simple restriction

enzyme to digest genomic DNA, creating various

sizes of DNA fragments, each containing

their respective SNPs. However, only certain

sized fragments are applied to the array, so it’s

critical to design microarray probes against

those SNPs that are present on the DNA fragments.

For example, the Mapping 100K set

uses two separate restriction enzyme reactions,

each of which creates a pool of DNA fragments

containing over 50,000 SNPs to be genotyped.

The same strategy is now being used on the

500K to genotype up to 500,000 SNPs – more

SNPs than ever before possible.

Genotyping up to 10,000 custom SNPs

A new generation of genotyping microarrays

and assays now enable researchers to

perform large-scale genotyping in their own

labs with their own panels of SNPs. Highdensity

genome-wide genotyping of custom

Fig. 1: This microarray probe-set strategy enables scientists to quickly determine whether a genome

contains 2 copies of the A allele (AA), two copies of the B allele (BB) or one copy of each (AB).

SNPs for focused mapping studies or for

candidate-gene association studies requires a

method to simultaneously amplify thousands

of selected SNPs and an equally scalable way

to determine the genotype of each SNP under

study. Newly developed MegAllele assays and

GeneChip microarrays are now being used to

genotype up to 10,000 targeted SNPs using

only a single assay and a single microarray.

These assays offer researchers the ability

to focus on specific regions of the genome

more quickly and in greater detail than ever

before. Researchers studying candidate genes

or other regions of the genome have typically

genotyped relatively few SNPs per experiment

due to cost and ease-of-use hurdles. The new

array-based assay lets scientists successfully

genotype more of the SNPs they want in a

single, flexible assay.

28 | 6. Jahrgang | Nr. 6/2005 LABORWELT

Assay

Molecular Inversion Probe (MIP) technology

enables scientists to amplify up to 10,000 targeted

SNPs in one highly multiplexed experiment

that combines 10,000 different PCR reactions

in a single tube. When the SNP sequence

is amplified during the PCR, a fluorescent base

is incorporated at the variable SNP position,

and depending on the genotype – either an A,

T, C or G – the DNA will contain either a green,

blue, purple or red fluorescent molecule.

Probe strategy

Researchers then use microarrays to detect

each SNP sequence, image the associated

fluorescent color and ultimately

determine the final genotype. Every probe

on the microarray surface is designed to

detect a different SNP by hybridizing to

a DNA sequence that acts as a SNP identifier;

each of the 10,000 PCR primers in the initial

MIP assay contains one of 10,000 unique

DNA sequences that serves as a unique tag

for each of the 10,000 single nucleotide polymorphisms.

The scalable targeted genotyping method

uses a four-color high-resolution scanner to

image the fluorescence associated with each

probe – red corresponds to a thymine genotype,

green to a adenine genotype, blue to a

guanine genotype, and purple to a cytosine

genotype. If a SNP sequence is imaged as a

pure red square, scientists will know that both

alleles of the SNP contain a “T” nucleotide – a

“T/T” genotype – because only the thymine

nucleotides that were incorporated during

the MIP assay had red fluorescence.Likewise,

if the probe lights up as pure green, scientists

know both alleles are an “A” nucleotide – or a

“A/A” genotype – because green fluorescence

corresponds to adenine. If a probe fluoresces

yellow; however, scientists know that the SNP

contains one red “T” allele and one green “A”

allele that combine to make a yellow “T/A”


�������������������

��������������������

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B L I T Z L I C H T

Fig. 2: Array manufacturing. Affymetrix production operator loads a wafer into the modular oligosynthesizer,

which performs sequential addition of phosphor ammodites to the wafer.

genotype. By examining these combinations of

colors for as many as 10,000 SNPs on a single

array, researchers can determine the exact

genotype for each targeted SNP detected and

imaged on the microarray.

Discovering the genetics

of complex disease

High-density genotyping microarrays enable

scientists to conduct whole-genome

association studies today to understand

the genetics of complex disease or drug

response. Scientists like Josephine Hoh at

the Yale University are able to home in on

disease-associated mutations by using 100K

SNP microarrays that provide the genetic

information processing power needed to

identify a key mutation associated with agerelated

macular degeneration. Hoh’s recent

study, published in the April 2005 issue of

Science, scanned 100,000 SNPs from just 146

people; previous technologies that looked at

far fewer SNPs would have required Hoh to

study thousands of people to generate results

with the same scientific significance.

Larger association studies can also be designed

to help identify the comprehensive

catalog of genes, pathways, and predictive

biomarkers associated with disease. The Serono

Institute used the Mapping 100K Set to

identify 80 genes related to multiple sclerosis

(MS). Serono scientists expect to find many

more genes with the Mapping 500K Set, that

they expect will fall into five to ten different

disease pathways.

Often the ideal experiment tests a preexisting

hypothesis about particular genes,

pathways, or regions of the genome. Dr. John

Todd of Cambridge University’s Juvenile

Diabetes Research Foundation/Wellcome

Trust Diabetes and Inflammation Laboratory

(DIL) is among the first to use MegAllele pan-

els of 10,000 non-synonymous SNPs - SNPs

that change the sequences of proteins – for

a whole-genome association study to find

genes contributing to type 1 diabetes. Todd’s

research group is comparing the SNP profiles

between 1,000 control samples and 1,000 diabetic

samples; he plans to analyze more than

20,000 DNA samples already collected from

diabetes patients and their relatives.

Discovering the genetics

of variable drug response

Studies to identify genes associated with drug

response, efficacy and toxicity may become

one of the most promising applications for

whole-genome DNA analysis. Microarrays

able to genotype more than 500,000 SNPs

distributed across the genome now allow

researchers to readily genotype large populations

of responders vs. non-responders to a

given drug for phenotypes including efficacy

and toxicity. With these kinds of genetic studies,

scientists hope to elucidate the genes

contributing to variable drug response.

In late-stage clinical trials for example,

microarray genotype analysis could be used to

stratify patient populations to eliminate poor

or toxic responders from key Phase III trials.

Such stratification would help ensure maximum

effectiveness through clearer statistical

differentiation between drug and placebo,

while also reducing size and cost of trials and

improving the odds of drug approval. In addition,

once a drug is on the market, patient

stratification could be used to accelerate drug

expansion into new indications through faster,

smaller, more definitive Phase IV trials, or to

establish medical superiority of a late-to-market

drug relative to entrenched competitors in

an important class of patients. Genome-wide

genotype information will also fuel future

research. By better understanding genetic

mechanisms of drug response in patients, researchers

will have made significant progress

on finding the next generation drug.

Already, leading pharmaceutical, biotech,

and university researchers have embraced

microarray genotyping technology. Researchers

in a pharmacogenomic study at the Mayo

Clinic are using the 100K to investigate the

genetic basis for differential responses to

antihypertensive drugs in different patients

and populations. The scientists hope to

identify genes influencing drug response and

ultimately tailor antihypertensive therapy for

individual patients.

The way ahead

Whole-genome genotyping microarrays provide

scientists with a way of examining the

underlying genetics of responders and nonresponders

without any of the assumptions or

limitations used in a candidate-gene approach.

For most drugs with variable responses, little

is known about why they work in some

patients and why not in others. Genotyping

microarrays enable scientists to explore the

whole genome and identify predictive markers

of disease and drug-response, that may

ultimately provide more tailored, effective

and safer courses of treatment and help avoid

the more than 100,000 annual fatalities from

adverse drug reactions in the US alone 11 .

References

[1] Fodor, S. P. et al. Light-directed, spatially addressable parallel chemical

synthesis. Science 251, 767-73 (1991).

[2] Fodor, S. P. et al. Multiplexed biochemical assays with biological chips.

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membrane fusion, cause arthrogryposis-renal dysfunctioncholestasis

(ARC) syndrome. Nat Genet 36, 400-4 (2004).

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of the testes syndrome (SIDDT) by a SNP genome scan and identification of

TSPYL loss of function. Proc Natl Acad Sci U S A (2004).

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maps to chromosome 10p12.1-p13. Diabetes 52, 2636-8 (2003).

[8] Uhlenberg, B. et al. Mutations in the Gene Encoding Gap Junction Protein

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degeneration. Science 308, 385-9 (2005).

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in hospitalized patients: a meta-analysis of prospective studies. Jama

279, 1200-5 (1998).

Contact

Greg Yap, Affymetrix Inc.

Vice President DNA Products

3380 Central Expressway

Santa Clara, CA 95051

Tel: +1-408-731-5000

Fax: +1-408-731-5380

www.affymetrix.com

30 | 6. Jahrgang | Nr. 6/2005 LABORWELT


Forschungsförderung


EUCOMM: The European

Conditional Mouse

Mutagenesis Program

Dr. Thomas Floss, Dr. Cornelia Kaloff und Prof. Dr. Wolfgang Wurst

Institut für Entwicklungsgenetik, GSF-Forschungszentrum für Umwelt und Gesundheit,

Neuherberg

Eine der größten aktuellen Herausforderungen für die Biowissenschaften ist es, die Funktion

unserer Gene in Krankheit und Gesundheit aufzuklären. Die Mutation von Genen ist hierbei

ein wichtiges Hilfsmittel, denn sie führt zu Funktionsverlusten im Organismus; hierdurch

läßt sich erkennen, welche Aufgabe die Gene normalerweise erfüllen. Mäuse sind für die

Aufklärung von Genfunktionen ideale Modellorganismen, da sich das Erbgut von Mensch und

Maus zu etwa 99% gleicht und die grundlegende Physiologie beider Organismen sehr ähnlich

ist. Wissenschaftler gehen daher davon aus, durch die Mutation von Mausgenen und die Erzeugung

von Mausmodellen einen besseren Einblick in die Entstehung genetisch bedingter

Volkskrankheiten erhalten zu können.

Die Europäische Union hat nun mit EU-

COMM (European Conditional Mouse

Mutagenesis Program) 1 ein ambitioniertes

europäisches Programm ins Leben gerufen,

in dessen Rahmen bis zu 20.000 Mausgene

durch Mutationen inaktiviert werden sollen

– dies entspricht etwa 70% des gesamten

Mausgenoms. Dieses ehrgeizige Ziel kann

N E T Z W E R K

nur durch die intensive internationale Zusammenarbeit

hochrangiger Forschungsteams

erreicht werden. Das GSF-Forschungszentrum

für Umwelt und Gesundheit in München/Neuherberg

und das Sanger Institute

in Hinxton, Cambridge, Großbritannien,

spielen hierbei eine führende Rolle. Prof. Dr.

Wolfgang Wurst, Direktor des GSF-Instituts

Kennziffer 22 LW 06 · Informationen ordern? · www.biocom.de

für Entwicklungsgenetik, ist Koordinator von

EUCOMM, für das die EU in ihrem sechsten

Forschungsrahmenprogramm insgesamt 13

Millionen Euro zur Verfügung stellt.

Der im Rahmen von EUCOMM geplante

genomweite Mutageneseansatz ist notwendig,

weil derzeit, laut OMIM-Datenbank

(www.ncbi.nlm.nih.gov), nur rund 2.000 Genorte

mit menschlichen Krankheiten in Verbindung

gebracht werden können. Bei etwa 3.500

Krankheiten sind die genetischen Grundlagen

immer noch unbekannt. Die in Mausmodellen

von der Wissenschaftsgemeinschaft insgesamt

bisher vorgenommenen Inaktivierungen

(Knock-outs) von Genen belaufen sich zudem

auf lediglich 10% der bekannten Mausgene

(Stand 2004; Abb. 1). Zudem handelt es sich

bei nur etwa 100 aller Knock-outs um konditionale

Inaktivierungen.

Das anstehende EUCOMM-Projekt ist die

derzeit weltweit größte Plattform zur Mutagenese

des Mausgenoms. Das erklärte mittelfristige

Ziel von EUCOMM ist es, der Wissenschaftsgemeinschaft

für nahezu jedes Gen

eine konditionale Mutation in embryonalen

Stammzellen (ES-Zellen) der Maus zur Verfügung

zu stellen. Vor allem ist es das Potential

der embryonalen Stammzelltechnologie mit

allen heute denkbaren Möglichkeiten zur

genetischen Manipulation und Hochdurchsatzanalyse,

welches den Ausschlag gegeben

hat, EUCOMM zu diesem Zeitpunkt in Angriff

zu nehmen. Embryonale Stammzellen

lassen sich zudem einfrieren und können so

einfach weltweit transportiert werden. Die

Effektivität dieses Ansatzes wurde in der

Abb. 1: Aus der Beschreibung genetisch bedingter Krankheiten kennen wir die Funktionen von lediglich etwa 2.000 humanen Genen (rechts). Auch

nach 15 Jahren Knock out-Technologie sind nur etwa 10% aller Mausgene mindestens einmal mutiert worden. Nur etwa 100 dieser 2.669 Mutanten

tragen konditionale Mutationen, die auch das Studium der Genfunktion zu bestimmten Zeitpunkten (links) oder in bestimmten Geweben erlauben.

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LABORWELT 6. Jahrgang | Nr. 6/2005 | 31


A B

C

N E T Z W E R K

Abb. 2: A. Das FLEX-System bietet die Möglichkeit zur konditionalen Mutagenese. Zwei mutagene

Kassetten werden von einer Kombination von mutierten und Wildtyp-Rekombinase-Erkennungs-Sites

flankiert. Die FLPe-Rekombinase wird jeweils nur zwischen den homologen Erkennungsstellen

rekombinieren (hier: grün und grün oder gelb und gelb). Weil aber die Orientierung

der Sites gegenläufig ist, wird die Rekombinase die Kassette jeweils nur zwischen grün oder

gelb umdrehen. Dies sind jeweils transiente, reversible Zustände (hier gezeigt für Rekombination

zwischen den gelben Sites). Dabei kommt jedoch immer eine gelbe bzw. eine grüne Site auf

die andere Seite der Kassette und ist nunmehr mit der jeweils anderen kompatiblen Site gleich

orientiert. In diesem Fall wird die Rekombinase zwischen diesen beiden Stellen rekombinieren

und dabei die nicht-kompatible Site dazwischen ausschneiden (step 1). Das Ergebnis ist in jedem

Fall das gleiche: die mutagene Kassette ist irreversibel in eine nicht-mutagene Richtung gedreht

und nunmehr von zwei inkompatiblen FLPe-Stellen flankiert. Nutzt man zwei unterschiedliche

Rekombinasen (hier Cre-Rekombinase und rote bzw. pinkfarbene loxP-Sites), so kann man auf

diese Weise Kassetten lediglich in bestimmten Geweben oder aber zu unterschiedlichen Zeitpunkten

der Entwicklung mutagen wirken lassen beziehungsweise frühe Letalität umgehen.

B: Beim Targeted Trapping werden promotorlose konditionale Genfallenvektoren mit Hilfe der

homologen Rekombination in das erste Intron von Genen gebracht, welche in ES-Zellen zwar exprimiert,

aber aus unterschiedlichen Gründen bislang nicht getrappt wurden. Dort funktionieren

sie genau wie konventionelle Genfallenkassetten. Diese promotorlosen Konstrukte haben eine

ungewöhnlich hohe Rekombinationsrate.

C: Beim Gene Targeting werden Selektionskassetten mit eigenen Promotoren benutzt, welche

nach der Drehung durch FLPe eliminiert werden können, weil sie zwischen zwei frt-sites lokalisiert

sind. Auch dieser Ansatz wird eine Insertions-Mutagenese sein. Durch Einbringen einer

zweiten loxP-site in den Lokus können jedoch auch Cre-vermittelte Deletionen induziert werden.

Vergangenheit insbesondere von den Mitgliedern

des International Gene Trap Consortium

(IGTC; www.igtc.org; Abb. 3) demonstriert.

Zusammengenommen wurden beim IGTC

mehr als 2.000 mutierte Maus-ES-Zellen von

der Wissenschaftsgemeinschaft angefordert,

um an allen Orten der Welt Mausmutanten zu

produzieren. Die Mitglieder des IGTC haben

sich auch bei der Akquisition von Fördermitteln

gegenseitig inspiriert. Die europäischen

Partner des IGTC, namentlich das German

Gene Trap Consortium (Wolfgang Wurst)

und das Sanger Institute (Allan Bradley),

sind maßgeblich an der Realisation und Koordination

von EUCOMM beteiligt, während

die nordamerikanischen Partner in Manitoba

(Geoff Hicks) und Toronto (Janet Rossant)

ein komplementäres Verbundprojekt (Nor-

COMM) auf der anderen Seite des Atlantik

anführen werden.

Das EUCOMM-Konsortium ist ein Zusammenschluß

von 11 hochrangigen Institutionen

aus vier europäischen Ländern.

Die EUCOMM-Partner werden konditionale

Mutationen in insgesamt bis zu 20.000 Mausgenen

mithilfe von ‚gene trapping‘, ‚targeted

trapping‘ und ‚gene targeting‘-Ansätzen

generieren (siehe Abb. 2a-2c). Zudem werden

bis zu 300 konditionale Mausmutanten

etabliert und archiviert werden.

Insbesondere zwei neue Technologien, die

FLEX-Technologie (Schnütgen et al, 2005; s.

Abb. 2a) und die ‚targeted trapping‘-Technologie

(Friedel et al., 2005; s. Abb. 2b), werden

innerhalb des EUCOMM-Projektes in großem

Maßstab eingesetzt werden. Die targeted

trapping-Technologie ist, kurz gesagt, gene

trapping mit Hilfe der homologen Rekombination.

Dabei können von Splice-Akzeptor-

Genfallenvektoren auch diejenigen Gene

angesteuert werden, die zwar in embryonalen

Stammzellen exprimiert werden, aber bislang

nicht durch gene trapping mutiert werden

konnten – entweder weil sie zu klein sind

oder weil ihr Expressionsniveau zu niedrig

ist. Da dieser targeted trapping-Ansatz aber

nur für in ES-Zellen exprimierte Gene effizient

eingesetzt werden kann, müssen die nicht

exprimierten Gene durch gene targeting mu-

Abb. 3: Das Internationale Gene Trap Consortium

(IGTC; www.igtc.org) ist ein Zusammenschluß

der weltweit größten Gene

Trapping-Zentren, wobei das German Gene

Trap Consortium (GGTC; www.genetrap.de)

hinsichtlich der Anzahl der eingebrachten

Klone der größte Partner ist. Weitere Partner

sind das Sanger Institute, Großbritannien;

BayGenomics, USA; Fred Hutchinson, USA; Yamamoto,

Japan; Mount Sinai, Toronto; ESCDB,

Manitoba; TIGEM, Italien.

32 | 6. Jahrgang | Nr. 6/2005 LABORWELT


tiert werden. Eine der entscheidenden Fragen

bei der Planung von EUCOMM war: Wann

sollte man vom gene trapping zum targeted

trapping beziehungsweise zum gene targeting

wechseln? Dabei gab die Publikation

von Skarnes et al. (2004) wichtige Hinweise:

offensichtlich ist ‘gene trapping’ zur Mutation

von mehr als 60% des Genoms verwendbar.

Jedoch wird diese Technologie aufgrund des

unvermeidlichen Saturationseffektes, der

nach etwa 30% der Genommutation eintritt,

dann unwirtschaftlich, wenn pro 100 mutierten

Klonen nur noch fünf oder weniger neue

Gene „gefangen“ werden (Abb. 4).

Unter Einsatz dieser Technologien wird das

EUCOMM-Konsortium die bislang weltweit

größte Ressource mutierter embryonaler

Stammzellen der Maus erzeugen und sie

der Wissenschaftsgemeinschaft frei zur Verfügung

stellen.

Das EUCOMM-Konsortium

1. GSF-Forschungszentrum für Umwelt und Gesundheit, München Neuherberg,

Deutschland Prof Dr. Wolfgang Wurst (Koordinator)

Prof. Dr. Martin Hrabé de Angelis

2. Wellcome Trust Sanger Institute, Hinxton, Großbritannien Prof. Dr. Allan

Bradley (Ko-Koordinator) Dr. William Skarnes Dr. Pentao Liu Dr. Tony Cox

3. Klinikum der Johann Wolfgang Goethe-Universität Frankfurt/MainProf. Dr.

Harald von Melchner

4. Charité Universitätsmedizin Berlin, Deutschland, Prof. Dr. Patricia Ruiz

5. Technische Universität Dresden, Deutschland, Prof. Dr. Francis Stewart

6. Gene Bridges GmbH, Heidelberg, Deutschland, Dr. Gary Stevens

7. Institut Clinique de la Souris, Strasbourg, Frankreich, Prof. Dr. Pierre Chambon,

Prof. Dr. Johan Auwerx

8. European Molecular Biology Laboratory (EMBL), Monterotondo/Rom, Italien

Prof. Dr. Nadia Rosenthal

9. Medical Research Council, Mammalian Genetics Unit, Harwell, UK, Prof. Dr.

Steve Brown

10. Consiglio Nazionale Delle Ricerche, Istituto di Biologia Cellulare, Monterotondo/Rom,

Italien, Prof. Dr. Glauco Tocchini-Valentini

11. Deutsches Ressourcenzentrum für Genomforschung GmbH (RZPD), Berlin/

Heidelberg, Deutschland, Dr. Bernhard Korn

Literatur

[1] Auwerx, J., Avner, P., Baldock, R., Ballabio, A., Balling, R., Barbacid, M.,

Berns, A., Bradley, A., Brown, S., Carmeliet, P., Chambon, P., Cox, R.,

Davidson, D., Davies, K., Duboule, D., Forejt, J., Granucci, F., Hastie, N., de

Angelis, M.H., Jackson, I., Kioussis, D., Kollias, G., Lathrop, M., Lendahl,

U., Malumbres, M., von Melchner, H., Müller, W., Partanen, J., Ricciardi-

Castagnoli, P., Rigby, P., Rosen, B., Rosenthal, N., Skarnes, B., Stewart,

A.F., Thornton, J., Tocchini-Valentini, G., Wagner, E., Wahli, W., and Wurst,

W. (2004). The European dimension for the mouse genome mutagenesis

program. Nat. Genet. 36, 925-927.

[2] Friedel, R.H., Plump, A., Lu, X., Spilker, K., Jolicoeur, C., Wong, K., Venkatesh,

T.R., Yaron, A., Hynes, M., Chen, B., Okada, A., McConnell, S.K., Rayburn, H.,

and Tessier-Lavigne, M. (2005). Gene targeting using a promoterless gene

trap vector (“targeted trapping”) is an efficient method to mutate a large

fraction of genes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102,13188-13193.

[3] Skarnes, W.C., von Melchner, H., Wurst, W., Hicks, G., Nord, A.S., Cox,

T., Young, S.G., Ruiz, P., Soriano, P., Tessier-Lavigne, M., Conklin, B.R.,

Stanford, W.L., and Rossant, J.; International Gene Trap Consortium (2004).

A public gene trap resource for mouse functional genomics. Nat. Genet.

36, 543-544.

[4] Schnütgen, F., De-Zolt, S., Van Sloun, P., Hollatz, M., Floss, T., Hansen,

J., Altschmied, J., Seisenberger, C., Ghyselinck, N.B., Ruiz, P., Chambon,

P., Wurst, W., and von Melchner, H, (2005). Genomewide production of

multipurpose alleles for the functional analysis of the mouse genome.

Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102, 7221-7226.

Kontakt

Dr. Cornelia Kaloff

Project Manager EUCOMM

eMail: cornelia.kaloff@gsf.de

Abb. 4: Die Antwort auf die Frage, wann das Gene Trapping sich nicht mehr lohnt und auf das

Targeted Trapping sowie das Gene Targeting gewechselt werden sollte, ergibt sich aus der steigenden

Saturation des Genoms mit Gene Trap-Mutationen: Nachdem etwa 25-30% der Gene in

ES-Zellen mutiert wurden, wird der Aufwand, neue Gene zu mutieren, höher als der Aufwand

beim Targeted Trapping. Mit dem Targeted Trapping wiederum können nur Gene mutiert werden,

die in ES Zellen exprimiert werden (ca.75-80%). Daher müssen die in ES-Zellen „stillen“ Gene per

Gene Targeting mutiert werden.

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LABORWELT 6. Jahrgang | Nr. 2/2005 | 33

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Lebensmittel-Diagnostik


Microarray-Diagnostik

von Allergenen

B L I T Z L I C H T

Dipl.-Biol. Dennie Andresen, Dr. Eva Ehrentreich-Förster, FhG IBMT, Nuthetal

Dipl.-Oecotroph. Eva-Maria Fiedler, Prof. Dr. Margitta Worm, Charité - Universitäts-

medizin Berlin, Klinik für Dermatologie, Venerologie und Allergologie, Berlin

Dr. Matthias Kuhn, CONGEN Biotechnologie GmbH, Berlin

Ende November tritt eine verschärfte, europaweit gültige Kennzeichnungspflicht für Lebensmittel

in Kraft, nach der sämtliche Inhaltsstoffe deklariert werden müssen. Um den

schnellen Nachweis einer großen Probenzahl zu ermöglichen und gleichzeitig preiswert

zu gestalten, wurden Möglichkeiten untersucht, die Detektion von Allergenen mit Hilfe von

Biochips zu ermöglichen.

Key Words: Nahrungsmittelallergie, Biochips, Real-time-PCR

Allergien beherrschen in zunehmendem

Maße unseren Alltag. Der Begriff selbst wurde

erstmals 1906 von dem Wiener Kinderarzt

Clemens von Pirquet geprägt. Seitdem

wächst die Zahl der Allergiker stetig. Nach

Angaben des Robert-Koch-Instituts in Berlin

haben 20% bis 30% der Bevölkerung schon

mindestens einmal in ihrem Leben eine allergische

Krankheit durchlebt.

Als häufigste Auslöser von allergischen

Reaktionen werden heute vor allem Stoffe

aus dem „Umweltbereich“ und in Lebensmitteln

diagnostiziert. Dabei können nahezu

alle Lebensmittel eine Allergie auslösen.

Verantwortlich hierfür sind Proteine und

Glykoproteine (Allergene), die von Natur

aus in einem Großteil der Lebensmittel

vorkommen und im Normalfall für den

Gesunden unschädlich sind.

Nahrungsmittelallergien –

Häufigkeiten, Symptome, Diagnostik

Nahrungsmittel-Unverträglichkeiten sind

in der Bevölkerung weit verbreitet. In der

Diagnostik und Therapie sind die Immunglobulin

E (IgE)-vermittelten gegenüber den

nicht-IgE-vermittelten Unverträglichkeiten

zu unterscheiden. Der Begriff Allergie steht

für eine immunologisch vermittelte Unver-

Abb. 1: Häufigkeit von Nahrungsmitteln, die bei einer repräsentativen Gruppe von Erwachsenen

(Alter 18-79 Jahre) in der doppelblinden plazebo-kontrollierten Nahrungsmittelprovokation

(DBPCFC) positive Reaktionen hervorrufen [modifiziert nach 1].

träglichkeit. Kinder unter drei Jahren sind

mit rund 6% die am häufigsten betroffene

Altersgruppe. Im Vergleich dazu sind etwa

3% der Erwachsenen von einer Nahrungsmittelallergie

betroffen. Im Kindesalter sind

Kuhmilch und Hühnerei die Hauptallergene.

Die allergische Reaktion verschwindet

allerdings bis zum Alter von fünf Jahren

bei etwa 85% der Kinder durch Toleranzentwicklung

1-3 .

Dementsprechend nimmt die Häufigkeit

von Allergien gegenüber Grundnahrungsmitteln

mit steigendem Lebensalter ab.

Jugendliche und Erwachsene leiden in erster

Linie unter einer Allergie gegenüber Inhalationsallergenen,

wie Hausstaubmilben,

Tierhaaren und den verschiedenen Pollenarten

(Baum-, Gräser-, Beifußpollen). Bei der

klassischen Nahrungsmittelallergie kommt

es üblicherweise durch die orale Aufnahme

zu einer Sensibilisierung und dann – nach

erneuter Aufnahme – zu einer allergischen

Reaktion, zum Beispiel der Haut, der Mundschleimhaut

oder dem Gastrointestinaltrakt.

Vor allem bei Erwachsenen ist ein anderer

Mechanismus häufiger. Hier kommt es

initial zu einer inhalativen Sensibilisierung

durch Pollenallergene. Aufgrund einer

Strukturähnlichkeit der Proteine (Allergene)

kann es später zu einer Kreuzreaktion

der allergieauslösenden Antikörper gegen

Pollen und bestimmte Nahrungsmittel

kommen. Diese Allergieform wird pollenassoziierte

Nahrungsmittelallergie genannt.

Zu den klassischen Kreuzallergenen bei

Birkenpollenallergie zählen die Haselnuß,

Stein- und Kernobst (zum Beispiel Apfel,

Pfirsich, Kirschen) und Gemüse wie Karotten

und Sellerie. In eigenen Untersuchungen

zur Häufigkeit der Nahrungsmittelallergie

in Deutschland wurde gezeigt, daß Nüsse,

Stein- und Kernobst die häufigsten Auslöser

von allergischen Reaktionen bei Erwachsenen

sind (vergl. Abb.1) 1 .

Die klinischen Reaktionen einer Nahrungsmittelallergie

können unterschiedlich

schwer verlaufen, von sehr milden und

lokalen Reaktionen der Mundschleimhaut

(orales Allergie-Syndrom) über generalisierte

Hautreaktionen (zum Beispiel Urtikaria)

bis zum anaphylaktischen Schock 2,3 .

Zur Diagnostik einer Nahrungsmittelallergie

gehört neben den in vivo- (Hauttest) und

in vitro-Tests (IgE-Antikörperbestimmung)

auch die Eliminationsdiät mit anschließender

doppelblinder Plazebo-kontrollierter

Nahrungsmittelprovokation (DBPCFC) zur

Überprüfung der klinischen Relevanz 1,4 . Die

Therapie der Wahl bei einer nachgewiesenen

Nahrungsmittelallergie ist das strenge

Meiden der allergenen Nahrungsmittel. Ein

großes Problem für den Allergiker stellt die

derzeit noch gültige unzureichende Kennzeichnungspflicht

dar. Viele allergische

Reaktionen werden unerwartet durch den

Verzehr von verarbeiteten Nahrungsmit-

34 | 6. Jahrgang | Nr. 6/2005 LABORWELT


B L I T Z L I C H T

Kennziffer 23 LW 06 · Informationen ordern? · www.biocom.de �

teln ausgelöst, die nur unvollständige Zutatenlisten aufweisen. In

jüngerer Zeit sichern sich viele Hersteller durch Warnhinweise wie

„Kann Spuren von Nüssen enthalten…“ ab. Dies verunsichert den

betroffenen Allergiker allerdings eher und stellt keine echte Hilfestellung

für ihn dar.

EU-Kennzeichnungspflicht

Die Richtlinie 2003/89/EG der Europäischen Union (EU) fordert,

bis spätestens 25. November 2005 sämtliche Zutaten, die in Europa

zu den häufigsten Auslösern von Lebensmittelallergien gehören,

sowie Erzeugnisse daraus, immer zu kennzeichnen. Dies gilt auch

Abb. 2: Sellerie-Nachweis mittels Real-time-PCR. Der Kurvenanstieg

zeigt deutlich das Vorhandensein von Sellerie an. Je früher die Kurven

ansteigen, desto mehr Sellerie ist in der Probe enthalten. So lassen

sich auch quantitative Aussagen ableiten.

für Zutaten, die nur während der Herstellung – etwa als Hilfsstoff

– mit dem Produkt in Berührung kommen. Gekennzeichnet werden

müssen glutenhaltige Getreide wie Weizen, Gerste, Roggen und

Hafer sowie Fisch, Krustentiere (Crustaceen), Eier, Erdnüsse, Soja,

Milch (einschließlich Laktose), Schalenfrüchte (Nüsse), Sellerie, Senf,

Sesamsamen, Schwefeldioxid und Sulfite 5 . Die beiden letztgenannten

zählen zu den Zusatzstoffen und stellen keine Nahrungsmittelallergene

dar.

Zur Qualitätssicherung in der Lebensmittelproduktion und zur

Überwachung der Deklarationspflicht werden leistungsfähige,

sichere und robuste Nachweisverfahren benötigt.

Stand der Technik

Der Nachweis von Allergenen ist heute auf die unterschiedlichste

Art und Weise möglich: So gibt es immunologische Proteintestkits

(ELISA), DNA-Test oder chemisch/enzymatische Tests. ELISA-

Tests werden momentan vor allem für die Bestimmung von Gluten

beziehungsweise Gliadin, von Ei- und Milchproteinen eingesetzt,

aber auch für den Nachweis von Hasel- und Erdnüssen. DNA-Tests

kommen dagegen vor allem beim Nachweis von Sellerie, Senf, Fisch,

Crustaceen, Soja, Pistazien, Wall- und Pekannüssen zum Einsatz.

Als enzymatische Tests sind der Sulfittest, zum Beispiel für Knoblauch,

oder der Laktosetest für Backwaren oder Babynahrung

ausgelegt.

Kennziffer 24 LW 06 · Informationen ordern? · www.biocom.de �

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LABORWELT 6. Jahrgang | Nr. 6/2005 | 35

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Wegen der Bedeutung des Nachweises von

Lebensmittelallergenen wird im Rahmen

eines Kooperationsprojektes (AllergenChip)

ein System auf der Basis eines DNA-Chips

zum parallelen Nachweis der wichtigsten

Lebensmittelallergene entwickelt.

Entwicklung eines

Biochip-Testsystems

Im Zuge der Assayoptimierung liegt ein entscheidender

Fokus auf dem Einsparen von

Zeit und Kosten. Eine Möglichkeit hierfür

bietet die Möglichkeit der Multiplexanalyse,

also der parallele Nachweis verschiedener

Parameter in einem einzigen Versuchsansatz.

Die PCR-Verfahren bieten die Voraussetzung,

auch aus unterschiedlichsten

Lebensmittel- oder Rohstoffproben sensitiv

geringe Mengen oder Kontaminationen an

Lebensmittelallergenen zu detektieren. Die

Detektion erfolgt über die in der Lebensmittelanalytik

immer mehr an Bedeutung

gewinnende Real-time-PCR mit spezifischen

Hybridisierungssonden. Ein Einzelnachweis

von Sellerie mittels Real-time-PCR ist in

Abbildung 2 (S. 31) gezeigt.

Nachteil dieses Verfahrens ist, daß ein

Multiplexing nur begrenzt möglich ist. Für

die Differenzierung der mit Allergenen

assoziierten DNA-Sequenzen müßten diese

jeweils mit verschiedenen Fluoreszenzfarbstoffen

markiert werden. Hier kommt es zu

der Schwierigkeit, daß die herkömmlichen

Real-time-Cycler durch die Anzahl der

verfügbaren Detektionskanäle meist zu ein-

B L I T Z L I C H T

geschränkt sind, um mehrere verschiedene

Analyte parallel zu detektieren.

Eine Möglichkeit, dies zu umgehen,

bieten Microarrays. Durch ortsaufgelöste

Plazierung in Nanometer- bis Mikrometer-

Abständen können bis zu mehrere tausend

DNA-Sonden in einem definierten Raster

für die parallele Analyse genutzt werden.

Aufgrund dieser Tatsache kann bereits

mit nur einem Fluoreszenzfarbstoff eine

Multiplexdetektion erfolgen. Wegen der

Miniaturisierung, die mit dem Einsatz eines

Microarrays erzielt wird, sind nur geringe

Abb. 3: Nachweis vier verschiedener Lebensmittelallergene mit Hilfe des AllergenChips. Oben

dargestellt ist der parallele Nachweis von Soja (6), Walnuß (7), Sellerie (8) und Sesam (10) aus

einem DNA-Gemisch. Im Modell wurden die vier verschiedenen Lebensmittelallergensequenzen

in der PCR amplifiziert und anschließend über Hybridisierung auf dem AllergenChip nachgewiesen.

Das Chiplayout liegt in vierfacher Ausführung vor. Legende: 1. Negativkontrollen, 2. Hybridisierungskontrolle,

3. Haselnuß, 4. Erdnuß, 5. Mandel, 6. Soja, 7. Walnuß, 8. Sellerie, 9. Senf,

10. Sesam, 11. Gluten, 12. Fisch.

Probenvolumina nötig, um eine Detektion

durchzuführen.

Als mögliche künftige Anwendungsmöglichkeit

wurden die Entwicklung und der

Einsatz eines diagnostischen Low-density-

Microarrays innerhalb des AllergenChip-

Projektes definiert. Der AllergenChip soll in

der Lage sein, alle relevanten Lebensmittelallergene,

die sogenannten „Big 8“, mit Hilfe

spezifischer DNA-Sonden zu detektieren.

Methodik

Der methodische Ablauf für die Analyse potentiell

kontaminierter Lebensmittel umfaßt

im wesentlichen drei Schritte: Probenaufarbeitung,

PCR und Detektion auf dem Chip.

Zu Beginn der Analyse wird aus der zu

analysierenden Lebensmittelprobe die DNA

isoliert und für die PCR aufgearbeitet. Für

die Aufarbeitung der Lebensmittelproben

hat die Firma Congen spezielle DNA-Isolationskits

(SureFood PREP Allergen) entwickelt,

mit denen qualitativ hochwertige DNA aus

verschiedenen Lebensmittelmatrizes für die

weitere Anwendung extrahiert werden kann.

Die extrahierte Gesamt-DNA wird in einer

PCR eingesetzt. Für die Chip-PCR werden

die gleichen Primersysteme verwendet, die

auch in der Real-time-Diagnostik Anwendung

finden und dort bereits validiert wurden.

Während der PCR werden vorhandene

Kontaminationen mit DNA aus Lebensmittelallergenen

sensitiv detektiert und über

einen entsprechend modifizierten Primer

mit dem Fluoreszenzfarbstoff Cy5 markiert.

Die Fluoreszenzmarkierung ermöglicht die

spätere Detektion auf dem Microarray. Eine

weitere Zeit- und Kostenersparnis kann mit

Multiplex-PCR-Verfahren erzielt werden.

Diese werden derzeit getestet.

Ein wichtiger Faktor ist die Sensitivität

des Gesamtassays. Diese wurde dahingehend

optimiert, daß für alle Allergene eine

Nachweisgrenze im unteren ppm-Bereich

(< 10 ppm) erreicht wird.

Über die Hybridisierung an immobilisierten

Sonden erfolgt die Detektion auf dem Allergen-

Chip. Liegt eine Kontamination mit der DNA

eines der gesuchten Lebensmittelallergene vor,

so kann das zuvor in der PCR amplifizierte

DNA-Produkt an die komplementäre Sonde

auf dem Chip hybridisieren und über die Fluoreszenzmarkierung

ortsaufgelöst detektiert

werden. Die Auswertung und Quantifizierung

erfolgt mit Hilfe eines Microarray-Scanners

wie etwa dem im FhG-IBMT entwickelten

Low-cost-Scanner „Freader“.

In Modellversuchen konnten wir bereits

verschiedene Lebensmittelallergene erfolgreich

mit Hilfe des AllergenChips parallel

nachweisen (Abb. 3). Eine Erweiterung auf

weitere relevante Lebensmittelallergene ist

derzeit in der Testphase.

Literatur

[1] Zuberbier, T., Edenharter, G., Worm, M., Ehlers, I., Reimann, S., Hantke,

T., Roehr, C.C., Bergmann, K.E., Niggemann B.:Prevalence of adverse

reactions to food in Germany – a population study, Allergy 2004,

59:338-345.

[2] Roehr CC, Edenharter G, Reimann S, Ehlers I, Worm M, Zuberbier T,

Niggemann B. Food allergy and non-allergic food hypersensitivity in

children and adolescents. Clin Exp Allergy. 2004,34:1534-41.

[3] Moneret-Vautrin, D.A.,Morisset, M. Adult food allergy, Curr Allergy

Asthma Rep 2005, 5:80-5.

[4] Sicherer, S.H., Teuber, S.: Current approach to the diagnosis and management

of adverse reactions to foods; AAAAI Practice Paper; J Allergy

Clin Immunol 2004, 114: 1146-50.

[5] Koch, S. Verpackte Lebensmittel: Was bedeutet das Zutatenverzeichnis

für den Allergiker? Ernährungs-Umschau 2005, 52:108-111.

Korrespondenzadresse

Dr. Eva Ehrentreich-Förster

FhG IMBT

Arthur-Scheunert-Allee 114-116

D-14558 Nuthetal

Tel.: +49-(0)33200-88293

Fax: +49-(0)33200-88452

eva.ehrentreich@ibmt.fhg.de

www.ibmt.fhg.de

36 | 6. Jahrgang | Nr. 6/2005 LABORWELT


Proteomics


Brustkrebsfrüherkennung

durch SELDI-MS

Dr. Christine König, LifeLines GmbH, Husum; Dr. Christoph Mundhenke, Dr. Ivor Meinhold,

PD Dr. Nicolai Maass, Frauenklinik, Universtätsklinikum Schleswig-Holstein Campus Kiel

Für die Diagnose des DCIS (ductal carcinoma in situ), einer frühen Form von Brustkrebs, wurde

das Proteom von Serumproben mittels SELDI-MS (surface enhanced laser desorption ionisation-mass

spectroscopy) untersucht. In den Spektren wurden differentielle Peaks identifiziert

und diese auf ihre Eignung zur Prognose des Krankheitsstadiums untersucht.

Die Erfolgsaussichten bei der Behandlung

von Brustkrebs sind umso besser, je früher die

Krankheit diagnostiziert wird. Im typischen

Fall entwickelt sich Brustkrebs über die intraduktal

wachsende Form des DCIS (ductal

carcinoma in situ) zum invasiven duktalen

Karzinom. Die Erkennung von DCIS kann mit

den bisherigen Verfahren – Palpation, Röntgen-

und Ultraschalluntersuchung – schwierig

sein. Deshalb besteht die Notwendigkeit, ein

ergänzendes Verfahren zur besseren Diagnostik

von DCIS zu entwickeln. Eine Diagnostik

anhand von Veränderungen im Proteom des

Serums würde für die Patientin eine deutlich

angenehmere Alternative zu den bisherigen

Verfahren darstellen, da hierfür nur wenige

Milliliter Blut abgenommen werden müssen.

Probensammlung

Die bisher durchgeführten proteombasierten

Untersuchungen wurden mit geringen

Probenzahlen (


Microarrays


ASK-Chip: Gezielte Analyse

des menschlichen Kinoms

Dr. Achim Knappik, MorphoSys - Antibodies by Design, Martinsried;

Dr. Michael Kubbutat, ProQinase, Freiburg; Dr. Hans-Jürgen Volkmer, NMI, Reutlingen

Derzeit sind mehr als 500 Proteinkinasen des Menschen bekannt, die durch Phosphorylierungen

die Aktivität von Proteinen modulieren, Zellsignale weiterleiten und damit nahezu

alle biologischen Prozesse beeinflussen. Proteinkinasen funktionieren als komplexes Netzwerk,

das bei vielen Erkrankungen gestört ist. Medikamente, die einzelne Proteinkinasen

hemmen, können diese Störungen eventuell beheben.

Das gezielte Zusammenwirken komplexer

Protein-Netzwerke im menschlichen

Körper ist eine Grundvoraussetzung für

das korrekte Ablaufen vieler molekularer

Prozesse. Eines der vielleicht bedeutendsten

Netzwerke hierbei ist das der Proteinkinasen

(PK), die die zweitgrößte Proteinfamilie im

menschlichen Genom überhaupt darstellen

– fast 2% aller menschlichen Gene kodieren

für Proteinkinasen. Die Enzyme fungieren

als Schaltelemente und beeinflussen die

meisten Funktionen im Stoffwechsel sowie

das Wachstum und die Differenzierung

der verschiedenen Zelltypen. Eine Reihe

von Kinasen steht folglich im Verdacht,

T E C H - T R A N S F E R

bei verschiedenen Krankheiten, wie Krebs,

Entzündungen oder Herz-Kreislauf-Erkrankungen,

eine zentrale Rolle zu spielen. Der

gezielte Einsatz von Medikamenten könnte

theoretisch individuelle Fehlfunktionen einzelner

Proteinkinasen und damit ausgelöste

Kettenreaktionen innerhalb des gesamten

Netzwerkes entgegenwirken. Bislang fehlen

jedoch ein umfangreiches Gesamtbild und

Verständnis dieses Netzwerkes, um die

Auswirkungen von Medikamenten auf das

Zusammenspiel aller Vertreter realistisch

abschätzen zu können. Die Medikamentenforschung

in diesem Bereich benötigt

deshalb neue, optimierte Werkzeuge.

In einem solchen Projekt wollen derzeit die

Freiburger ProQinase als Geschäftseinheit

der KTB Tumorforschungs GmbH, das

Naturwissenschaftliche und Medizinische

Institut (NMI), Reutlingen, und die Morpho-

Sys-Geschäftseinheit Antibodies by Design

ein neues Analyse-System etablieren. Das

vom Bundesministerium für Bildung und

Forschung (BMBF) geförderte Projekt hat sich

die Bereitstellung von Werkzeugen für die

Analyse aller menschlichen Proteinkinasen

– des menschlichen „Kinoms“ – zum Ziel

gesetzt. Hierbei werden sowohl die Proteinkinase-Plattform

von ProQinase, spezifische

Antikörper aus der HuCAL ® -Bibliothek von

Antibodies by Design als auch siRNA- und

BioChip-Technologien des NMI miteinander

kombiniert. Aus der Zusammenarbeit wird

ein adenoviraler siRNA-Kinom-Chip (ASK)

hervorgehen, der als Komplettsystem die

gleichzeitige Inhibition aller menschlichen

Proteinkinasen, und damit deren Funktionsanalyse

ermöglichen wird.

Interdisziplinärer Ansatz

Ein solch interdisziplinärer Ansatz ist natürlich

vor etliche Herausforderungen gestellt.

Von zentraler Bedeutung sind insbesondere

hinreichende Mengen gereinigter Proteinkinasen

für die Antikörperentwicklung, die

Etablierung von Methoden zur gezielten

Abschaltung von Proteinkinasen in Primärzellinien

und zugleich die Herstellung hochspezifischer

Antikörper zur Validierung der

Abb.: Arrays aus immobilisierten Adenoviren für die Reverse Transduktion und Expression von Genen: Die Infektion einer immobilisierten Zielzelle

mit löslichen Adenoviren kann räumlich umgekehrt werden, indem Adenoviren immobilisiert werden, an die resuspendierte Zellen binden –

reverse Transduktion (links). Erfolgreiche Expression des Gens für das Green Fluorescent Protein (GFP) in Zellen nach reverser Transduktion eines

rekombinanten GFP-übertragenden Adenovirus. Zellen siedeln sich bevorzugt an virale Spots an (rechts).

40 | 6. Jahrgang | Nr. 6/2005 LABORWELT


Proteinkinasen-Expression. Derzeit herrscht

akuter Mangel an Antikörpern gegen einen

Großteil der Kinasen. Dieser Engpaß soll

im Rahmen des Projektes mit Hilfe der

HuCAL ® -Technologie von Antibodies by

Design behoben werden – bis zu 270 neue

Antikörper gegen Proteinkinasen sollen entwickelt

werden. Zur gezielten Blockierung

der Expression ausgewählter Proteinkinasen

kommen short-interfering RNAs (siRNAs)

zum Einsatz, die durch rekombinante Vektoren

endogen exprimiert werden. Erfolg oder

Mißerfolg des Abschaltens der gewünschten

Proteinkinasen wird dann mit Hilfe der Kinase-spezifischen

Antikörper für jedes einzelne

siRNA-Konstrukt von ProQinase und dem

NMI überprüft.

Der ASK-Chip

Beim ASK-Chip (Adenoviraler siRNA Kinom

Chip) handelt es sich um einen neuartigen

Zellchip, der durchsatzfähige zelluläre

Systeme mit endogen exprimierter siRNA

verknüpft.

Methode

Auf einem Glasträger werden infektiöse

rekombinante Adenoviren in Form eines

Microarrays immobilisiert, die die Erbinformation

funktionell validierter shRNA-

Sequenzen tragen. Auf solchen adenoviralen

Arrays ausgesäte Zellen werden spezifisch

auf den Spots durch Wechselwirkung mit

den immobilisierten Adenoviren festgehalten.

Gleichzeitig können rekombinante Gene

durch die immobilisierten Adenoviren in die

Zellen übertragen werden.

Ausblick

Mit der im Projektverlauf erstellten Bibliothek

von validierten, adenoviralen Vektoren, die

die Expression aller humanen Kinasen durch

siRNA-vermittelte Inhibition dauerhaft

unterdrücken können, ist auch eine Analyse

von schwer transfizierbaren Zellen, wie zum

Beispiel primären Zellen, möglich. Das Arrayformat

gewährleistet dabei die parallele und

miniaturisierte Übertragung von Genen im

erhöhten Durchsatz. Bisher fehlte ein Ansatz,

der eine parallele funktionelle Analyse aller

menschlichen Proteinkinasen in lebenden

Zellen und gleichzeitig eine Miniaturisierung

durch den Einsatz der Chip-Technologie

ermöglicht.

Korrespondenzadresse

Dr. Achim Knappik

Antibodies by Design –

a Division of MorphoSys

Tel: +49-(0)89-89927-234

Fax: +49-(0)89-89927-5234

eMail: knappik@A-by-D.com, www.A-by-D.com

T E C H - T R A N S F E R

RNA-Interferenz


Neuartiges siRNA-Design

verbessert RNA-Interferenz

Die RNA-Interferenz (RNAi) –. die Technik

mittels kurzer doppelsträngiger RNA-

Moleküle (siRNAs) über RNA-induzierte

Effektorkomplexe (RISC) gezielt Gene

auszuschalten – hat seit ihrer Entdeckung

vor wenigen Jahren die Molekularbiologie

Abb: Nur unstrukturierte antisense-siRNAs

(links) können effizient RNA-Interferenz

(RNAi) induzieren. Auf der Basis einer neuen

Software können hochaktive unstrukturierte

antisense-siRNAs gezielt identifiziert und designt

werden.

revolutioniert. SiRNAs sind heute einerseits

wichtige Werkzeuge bei der funktionalen

Validierung unbekannter Genfunktionen,

andererseits rücken sie zunehmend in den

Fokus einer RNA-basierten Wirkstoffentwicklung.

Statistisch weist allerdings nur ein

kleiner Teil aller siRNAs, die sich gegen ein

bestimmtes Ziel(Target)-Gen richten lassen,

eine befriedigende Aktivität auf, und ein

treffsicheres Design aktiver Moleküle stellt

nach wie vor eine Herausforderung dar.

Gezielte Auswahl aktiver siRNAs

Bisher basierte die Auswahl aktiver siRNA

Duplexe, welche aus einer ‚antisense-siRNA’

(as-siRNAs) und einer ‚sense-siRNA’ bestehen,

im wesentlichen auf der Berücksichtigung

thermodynamischer Duplexparameter,

bestimmter Basenabfolgen und Basengehalte

sowie gegebenenfalls auf der Analyse von

Strukturen der Target-mRNAs. Die Arbeits-

Dr. Volker Patzel, Max-Planck-Institut für Infektionsbiologie, Berlin

gruppe von Dr. Volker Patzel in der von Prof.

Dr. Stefan Kaufmann geleiteten Abteilung

für Immunologie des Berliner Max-Planck-

Instituts für Infektionsbiologie konnte

kürzlich zeigen, daß die bisher vernachlässigten

Sekundärstrukturen der as-siRNAs die

RNAi-Effizienz entscheidend beeinflussen.

Je weniger Struktur die as-siRNA aufweist,

desto besser kann diese vermutlich RISC an

die mRNA heranführen, und desto aktiver ist

die siRNA. Am vielversprechendsten sind dabei

völlig unstrukturierte as-siRNAs. Durch

gezielte Basenaustausche werden diese

hochaktiven, aber seltenen unstrukturierten

as-siRNAs außerdem in ausreichendem Maße

zugänglich gemacht.

Neues Tool

Eine systematische Computeranalyse deutet

ferner darauf hin, daß auch bei den mikroRNAs

(miRNAs) die Strukturen der den

as-siRNAs entsprechenden reifen miRNAs,

eine wichtige Rolle spielen. MiRNAs repräsentieren

natürliche zelluläre Analoga zu den

siRNAs, und es wird heute davon ausgegangen,

daß ein großer Teil der menschlichen

Genexpression durch miRNAs gesteuert

wird. Damit kommt dieser Arbeit neben der

anwendungsbezogenen auch eine grundlagenwissenschaftliche

Bedeutung zu.

Die Ergebnisse dieser Arbeit, die in Kooperation

mit dem Deutschen Rheuma-Forschungszentrum

erfolgte, wurden kürzlich

in der Zeitschrift NATURE BIOTECHNOLOGY (online:

30. Oktober 2005, doi: 10.1038/nbt1151)

veröffentlicht. Das neuartige siRNA-Design

wurde in eine Software implementiert und

ist über das Steinbeis Transferzentrum

Nucleic Acids Design (www.stz-nad.com)

erhältlich.

Korrespondenzadresse

Dr. Volker Patzel, MBA

Arbeitsgruppenleiter

Abteilung für Immunologie

Campus Charité Mitte

Max-Planck-Institut für Infektionsbiologie

Schumannstraße 21/22

D-10117 Berlin

eMail: patzel@mpiib-berlin.mpg.de

www.mpiib-berlin.mpg.de

LABORWELT 6. Jahrgang | Nr. 6/2005 | 41


RZPD


Neuer Diagnostik–Service:

Der AmpliChip CyP450-Test

Dr. Florian Wagner, Dr. Johannes Maurer, Dr. Uwe Radelof

RZPD Deutsches Ressourcenzentrum für Genomforschung, Berlin

Das RZPD Deutsches Ressourcenzentrum für Genomforschung (www.rzpd.de) baut sein Service-Angebot

im Bereich DNA-Microarray-Technologie um den Bereich DNA-Diagnostik aus.

Die Etablierung des AmpliChip CYP450-Tests von Roche Diagnostics erfolgt als konsequente

Erweiterung der Technologieplattform des RZPD: Seit 2001 ist das RZPD offizieller Affymetrix-Service-Provider;

die NimbleGen-Technologie wird durch das RZPD seit 2004 exklusiv in

Deutschland und Österreich angeboten. Im Rahmen des Nationalen Genomforschungsnetzes

(NGFN) fungiert das RZPD als „Zentrale Microarray-Plattform“.

DNA-Microarrays wurden seit ihrer erstmaligen

Beschreibung zu Beginn der neunziger

Jahre 1 zu einem der wichtigsten Instrumente

der funktionellen Genomforschung weiterentwickelt.

Inzwischen wird die DNA-

Chiptechnologie auch in der Diagnostik

eingesetzt. Prominentes Beispiel ist der erste

in den USA und Europa für den klinischen

Einsatz zugelassene DNA-Chip mit CE-IVD-

Kennzeichnung für die Routinediagnostik: der

AmpliChip ® CyP450 von Roche Diagnostics.

Der Chip, der auf der Technologie des Microarray-Weltmarktführers

Affymetrix basiert,

repräsentiert 33 Varianten der zwei Gene 2D6

und 2C19 der Cytochrom-P450-Genfamilie.

Die hauptsächlich in der Leber exprimierten

Genvarianten dieser beiden Enzyme sind an

der Verstoffwechselung von etwa 25% aller

verschreibungspflichtigen Medikamente beteiligt.

Abhängig von der individuellen genetischen

Ausstattung, die einen erheblichen Einfluß

auf die Wirksamkeit und Verträglichkeit

der verabreichten Medikamente hat, erreichen

bei Standarddosierung viele Medikamente

keinen therapeutisch wirksamen Serumspiegel

(bei sehr schnellen Metabolisierern), oder

es wird im umgekehrten Fall (bei langsamen

Metabolisierern) über einen längeren Zeitraum

ein so hoher Serumspiegel erreicht (Abb.1),

daß schwere Nebenwirkungen die Folge sind.

Signifikante Arzneimittelnebenwirkungen

treten in ca. 5% bis 10% aller Fälle medikamentöser

Behandlung auf, nicht selten sogar mit

tödlichem Ausgang 2,3 . In Deutschland wird

mit jährlich 16.000 Todesfällen und 120.000

schweren Zwischenfällen gerechnet.

Der vom RZPD angebotene AmpliChip

CYP450-Test umfaßt folgende Schritte: Zunächst

werden in zwei Multiplex-PCR-Reaktionen

die allelischen Varianten von 2D6 und

2C19 amplifiziert. Ausgangsmaterial sind

lediglich 50 ng genomischer DNA, die aus

wenigen Millilitern Blut isoliert werden. Die

PCR-Amplifikate werden fragmentiert und

T E C H - T R A N S F E R

mit Biotin endmarkiert. Für die automatisierte

Hybridisierung, das Färben und Scannen des

Chips wird das bewährte Affymetrix-System

eingesetzt. Die Analyse der Rohdaten erfolgt

mit der von Roche entwickelten CYP450-

Datenanalyse-Software. Zur Analyse jeder

einzelnen der 33 Genvarianten, die auf dem

Chip repräsentiert sind, greift die Software

auf die Daten jeweils eines Blocks von 240

25mer-Oligonukleotiden zurück. Auf Basis des

ermittelten Genotyps erfolgt für 2D6 und 2C19

eine Aussage über den Phänotyp. Für 2D6 sind

vier Varianten möglich, von „langsamer Metabolisierer“

über „eingeschränkter Metabolisierer“

und „normaler Metabolisierer“ bis hin

zu „sehr schneller Metabolisierer“. Langsame

Metabolisierer haben zwei defekte Allele, bei

sehr schnellen Metabolisierern liegen mehr als

zwei voll funktionsfähige Allele vor. Für 2C19

werden zwei Phänotypen vorhergesagt: langsamer

oder normaler Metabolisierer. Auf der

Basis dieser Information kann der behandelnde

Arzt eine individuelle Entscheidung für das

am besten geeignete Medikament und die für

den jeweiligen Patienten wirksamste Medikamentendosis

treffen. Für Medikamente, die

von 2D6 und 2C19 umgesetzt werden, gibt es

bereits Dosisempfehlungen 4-6. Die Spannbreite

der empfohlenen optimalen Dosen liegt zwischen

30% und 260% der Standarddosis, je

nach Schnelligkeit der Metabolisierung.

Vorteile der DNA-Chipdiagnostik liegen

gegenüber anderen Verfahren im Multiplexing

sowie der Schnelligkeit: Der Test kann

an einem einzigen Arbeitstag durchgeführt

werden. Zudem kann die oft langwierige, mit

gesundheitlichen Risiken verbundene Ermittlung

der optimalen Medikamentendosis – die

„Einstellung“ des Patienten – in vielen Fällen

vermieden werden.

Die DNA-Chip-Diagnostik ist derzeit noch

sehr kostenintensiv. Ihr gezielter Einsatz kann

jedoch helfen, weit höhere Folgekosten zu

vermeiden. Folgt die Preisentwicklung der

Abb. 1: Gezeigt ist die Serumkonzentration

eines Wirkstoffs in Abhängigkeit von der Zeit

für einen schlechten (oben), normalen (Mitte)

und sehr schnellen Metabolisierer (unten). Rot

= Nebenwirkungen, grün = therapeutisches

Fenster, grau = unwirksamer Bereich

Diagnostik-Arrays jener der Forschungs-

Chips werden ihre Kosten mittelfristig

deutlich sinken – eine Tendenz, die durch die

Technologieentwicklung, einen umfangreicheren

Einsatz und die Markteinführung von

Konkurrenzprodukten verstärkt wird. Roche

selbst testet bereits in umfangreichen klinischen

Studien einen weiteren DNA-Chip zur

Leukämie-Klassifizierung, dessen Vermarktung

Anfang 2007 starten soll (Seite 6 ff.).

Literatur

[1] Fodor SP et al. (1991). Science 251, 767-773.

[2] Lazarou J et al. (1998). JAMA 279, 1200-1205.

[3] Schönhofer P (1999). Arzneimitteltherapie 17, 83-86.

[4] Brockmöller J et al. (2000). Pharmacogenomics 1, 125-151.

[5] Kirchheiner J et al. (2001). Acta Psychiatr Scand 104, 173-192.

[6] Roots I et al. (2004). Drug Metab Rev 36, 617-638.

Korrespondenzadresse

Dr. Florian Wagner

RZPD Deutsches Ressourcenzentrum für

Genomforschung GmbH

Heubnerweg 6, D-14059 Berlin

Tel.: +49-(0)30-32639-179, Fax: -262

eMail: f.wagner@rzpd.de, www.rzpd.de

42 | 6. Jahrgang | Nr. 6/2005 LABORWELT


M A R K T Ü B E R S I C H T

Marktübersicht: PCR- und Chip-Diagnostik

Das Multiplexing diagnostischer DNA-Tests, die bislang mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) durchgeführt wurden, eröffnet eine

massive Parallelisierung der Tests. Erstmals marktgerecht verwirklicht haben dies Weltmarktführer Roche Diagnostics und Affymetrix in

einem Chip-Test auf Arneimittelmetabolisierung. Doch innerhalb der Diagnostikbranche, die nach Angaben des VDGH im vergangenen Jahr

allein in Deutschland einen Umsatz von 450 Millionen Euro mit molekularen Diagnostika machte, sind weitere Tests in Entwicklung – zum

Beispiel Krebs-Arrays bei Bayer und Roche. Diese Marktübersicht wirft einen Blick auf die aktuellen, aber auch zukünftige Tests am Markt.

Greiner Bio-One GmbH

Maybachstraße 2

D-72636 Frickenhausen

Fax.: +49-(0)7022-948-514

Dr. Hinrich Habeck

hinrich.habeck@gbo.com

Tel.: +49-(0)7022-948-0

Greiner Bio-One GmbH

Maybachstraße 2

D-72636 Frickenhausen

Fax: +49-(0)7022-948-514

Dr. Jörg Stappert

joerg.stappert@gbo.com

Tel.: +49-(0)7022-948-0

Cambrex BioScience Verviers s.p.r.l.

Parc Industriel de Petit Rechain

4800 Verviers, Belgien

Technischer Service

Tel.: 0800-1825287

info.europe@cambrex.com

Cambrex BioScience Verviers s.p.r.l.

Parc Industriel de Petit Rechain

4800 Verviers, Belgien

Technischer Service

Tel.: 0800-1825287

info.europe@cambrex.com

1. Firmendaten, Ansprechpartner Cambrex BioScience Verviers s.p.r.l.

Parc Industriel de Petit Rechain

4800 Verviers, Belgien

Technischer Service

Tel.: 0800-1825287

info.europe@cambrex.com

ParoCheck ® Kit 20 CarnoCheck ®

Intelligene Human Cancer Chip

Ver. 4.0

2. Produktname Bacteria Screening PCR-Kit Bacillus anthracis PCR Detection

Kit

Parodontitis-Leitkeimbestimmung Qualitätskontrolle in der Lebensmittelindustrie

Identifizierung menschlicher

Krebsgene zu Forschungszwecken

Anthrax-Nachweis zur Risikoeinschätzung

in der Landwirtschaft

Qualitätskontrolle in der Lebensmittelüberwachung

3. Anwendungsgebiete

Microarry-basiertes Nachweissystem

zur Identifizierung von acht Tierarten

in Lebensmitteln. Das Kit umfaßt den

PCR-Mastermix, die Microarrays auf

HTATMSlide12-Plattformen, Hybridisierungs-

und Waschpuffer sowie die

CheckReportTM-Software Microarray-basiertes Nachweissystem

zur Identifizierung 20 Parodontitis-assoziierter

Keime

Chip mit ca. 890 cDNA-Fragmenten

(250- 1.200 bp) aus 590 identifizierten

und charakterisierten

humanen Krebs-Genen (mit Gen-

Namen, ID-Nummern,

Zugangsnummern Genbank)

Schnellnachweis von spezifischen

Genen (PA und capA) in den beiden

virulenten Anthrax-Plasmiden pX01

und pX02

Nachweis von 16S-rNA von Vertretern

der Enterobacteriaceae-Familie

(incl. E.coli und Salmonella) über

ENT-Primer sowie von Bacillus-

Arten (incl. Staphylococcus) über

BS-Primer

4. Kurzbeschreibung des Produktes

Schwein (Sus scrofa), Rind (Bos

taurus), Schaf (Ovis aries), Truthahn

(Meleagris gallopavo) , Huhn (Gallus

gallus), Pferd (Equus caballus), Esel

(Equus asinus), Ziege (Capra hircus

5. Organismus/Krankheit Bakterien Anthrax Krebs Nachgewiesen werden folgende

parodontal pathogene Keime: P.

gingivalis, T. forsythia, T. denticola,

C. gracilis, C. rectus, E. nodatum,

F. nucleatum ssp., P. micros,

P. intermedia, P. nigrescens, S.

Gruppe, A. odontolyticus, V. parvula,

A. actinomycetemcomitans, E.

corrodens, A. viscosus

LABORWELT 6. Jahrgang | Nr. 6/2005 | 43

Die Nachweisgrenzen liegen je nach

Art zwischen 0.05 und 1 % Produktanteil

in Kochkonserven

6. Technische Daten PCR-Kit für 50 Reaktionen PCR-Kit für 48 Reaktionen 2 cDNA-Chips Die Nachweisgrenzen liegen je

nach Erreger zwischen 100 und

5.000 CFU

gemäß der europäischen Richtlinie

98/79/EWG für in-vitro-Diagnostika

(IVD) bzw. dem deutschen

Medizinproduktegesetz (MPG)

zertifiziert

keine CE-Zertifizierung, für Forschungseinsatz

keine CE-Zertifizierung, für Forschungseinsatz

keine CE-Zertifizierung, für Forschungseinsatz

7. CE-zertifiziert/Forschungseinsatz?

8. Service

Für ein besonders effizientes Verfahren

sorgt das innovative HTATM- Slide12-Format des Biochips, mit dem

bis zu 12 Proben parallel bearbeitet

werden können. In Verbindung mit

dem CheckScannerTM und der Check-

ReportTM-Software ist eine vollautomatische

Analyse und Auswertung der

Ergebnisse möglich

Für ein besonders effizientes Verfahren

sorgt das innovative HTATM- Slide12-Format des Biochips, mit

dem bis zu 12 Proben parallel

bearbeitet werden können. In Verbindung

mit dem CheckScannerTM und der CheckReportTM-Software ist eine vollautomatische Analyse

und Auswertung der Ergebnisse

möglich.

9. Extras / Besonderheiten

10. Preis (ab…Euro) 905,- D 413,70 D 591,65 D


The Microarray Facility Tübingen

Calwerstr. 7

72076 Tübingen

www.microarray-facility.com

Dr. Michael Bonin

The Microarray Facility Tübingen

Calwerstr. 7

72076 Tübingen

www.microarray-facility.com

Dr. Michael Bonin

The Microarray Facility Tübingen

Calwerstr. 7

72076 Tübingen

www.microarray-facility.com

Dr. Michael Bonin

1. Firmendaten, Ansprechpartner Greiner Bio-One GmbH

Maybachstraße 2

D-72636 Frickenhausen

Fax.: +49-(0)7022-948-514

Dr. Hinrich Habeck

hinrich.habeck@gbo.com

Tel.: +49-(0)7022-948-0

Wirkstoffverträglichkeitstestung mit Hilfe des

AmpliChip CYP450 Arrays von Roche

Microarray High Density SNP-Analysen

• whole genome SNP Arrays (10K, 100K, 500K) • Meg-

Allel Arrays (flexible SNP Analysen) • Mouse, Rat, Bovine

SNP-Analysen

2. Produktname MycoDtectTM Microarray Expression Profiling

• Whole genome Expression Arrays (div. Spezies)

• Exon-Arrays

Wirkstoffverträglichkeitstestung

• Dosierungsanpassung von Medikamenten

Linkage-Analysen • Assoziationsstudien • Deletions/

Duplikations-Screening • Copy-Number-Analysen

Target Development • Pathway Definitions • Drug interaction

analysis • Animal model Screening

Qualitätssicherung von Zellkulturen in Forschung und

Produktion

3. Anwendungsgebiete

Analyse von 33 Polymorphismen zur Einschätzung

des individuellen Metabolisierungsgrades verschiedener

Wirkstoffe mit Hilfe des AmpliChip CYP450 und

der Affymetrix GeneChip-Technologie

Analyse genomweit verteilter SNPs mit Hilfe der Affymetrix

GeneChip-Technologie und

ParAllel-Technologie

Analyse des Transkriptoms mit Hilfe der Affymetrix

GeneChip-Technologie

Microarray-basiertes Nachweissystem zur Identifizierung

von Mycoplasmen. Mit spezifischen Sonden können

die neun häufigsten Mycoplasmen-Arten eindeutig

identifiziert werden. Darüber hinaus werden durch eine

universelle Sonde alle weiteren Mycoplasmen-Arten erfaßt.

• Der Kit umfaßt den PCR-Mastermix, die Microarrays

auf HTATM-Slide12-Plattformen, Hybridisierungsund

Waschpuffer sowie die CheckReportTM-Software. 4. Kurzbeschreibung des Produktes

M A R K T Ü B E R S I C H T

Human • Bei starken Nebenwirkungen von Medikamenten

oder bei Non-Response von Wirkstoffen

Human, Mouse, Rat, Drosophila, Arabidopsis Human, Mouse, Rat, Bovine • Mikrodeletionssyndrome

• Uniparentale Disomie-Diagnostik

Mycoplasmen allgemein und Mycoplasma orale, Mycoplasma

hyorhinis, Acholeplasma laidlawii, Mycoplasma

arginini, Mycoplasma fermentans, Mycoplasma hominis,

Mycoplasma gallisepticum, Mycoplasma pneumoniae,

Mycoplasma synoviae

5. Organismus/Krankheit

Diese Analyse ist die erste durch die FDA zugelassene

Microarray-basierte diagnostische Anwendung

und beinhaltet eine sehr robuste Genotypisierung,

die Klinikern und niedergelassenen Ärzten hilft, eine

individualisierte Dosierung bestimmter Wirkstoffe

für den Patienten vorzunehmen. Siehe auch www.

microarray-facility.com

44 | 6. Jahrgang | Nr. 6/2005 LABORWELT

Zum Einsatz kommt die neueste Variante des Affymetrix-Systems

mit Scanner Upgrade 7G und ParAllel-Erweiterung.

Siehe auch www.microarray-facility.com.

Zum Einsatz kommt die neueste Variante des Affymetrix-Systems

mit Scanner Upgrade 7G und ParAllel-Erweiterung.

Siehe auch www.microarray-facility.com

Die Nachweisgrenze liegt unter 20 CFU / ml oder unter

4 Kopien / PCR.

6. Technische Daten

Zum Einsatz kommt der erste CE-IVD und von der

FDA zugelassene diagnostische Microarray • Die

Microarray Facility ist als Teil der Medizinischen

Genetik zur Diagnostik zugelassen. • Weiterhin

ist sie als Affymetrix Service Provider zugelassen.

Dienstleistungen können für Industrie wie Akademie

erbracht werden

Die Microarray Facility ist als Teil der Medizinischen

Genetik zur Diagnostik berechtigt. • Weiterhin ist sie

als Affymetrix Service Provider zugelassen. • Dienstleistungen

können für Industrie wie Akademie erbracht

werden.

Als Affymetrix Service Provider zugelassen. • Dienstleistungen

können für Industrie wie Akademie erbracht

werden

7. CE-zertifiziert/Forschungseinsatz?

Der Service reicht von der DNA-Isolation aus EDTA-

Blut über die Microarray-Prozessierung bis hin zur

vollständigen Daten-Analyse und medizinischen

Befundung

Der Service reicht von der DNA-Isolation über Microarray-Prozessierung

bis hin zur vollständigen Daten-

Analyse

Der Service reicht von der RNA-Isolation über Microarray-Prozessierung

bis hin zur vollständigen Daten-

Analyse

8. Service

9. Extras / Besonderheiten

Für ein besonders effizientes Verfahren sorgt das innovative

HTATM-Slide12-Format des Biochips, mit dem

bis zu 12 Proben parallel bearbeitet werden können. In

Verbindung mit dem CheckScannerTM und der CheckReportTM-Software

ist eine vollautomatische Analyse und

Auswertung der Ergebnisse möglich.

10. Preis (ab…Euro) Ab 950,- D pro Expressionsanalyse Ab 400,- D pro SNP-Analyse Ab 400,- D pro Patient


QIAGEN Diagnostics GmbH

Königstraße 4a

22767 Hamburg

www.qiagen-diagnostics.de

Dr. Jens Dannenberg

Tel.: +49-(0)40-413647-88

ejens.dannenberg@qiagen.com

Molzym

Bremen

Tel. +49-(0)421-2209777-0

herrmann@molzym.com

Dr. Marc Bäuerle

Head of Marketing & Sales

Minerva Biolabs GmbH

Köpenicker Straße 325

D-12555 Berlin

Tel.: +49-(0)30-6576 2830

Fax: +49-(0)30-6576 2831

info@minerva-biolabs.com, www.minerva-biolabs.com

1. Firmendaten, Ansprechpartner Dr. Marc Bäuerle

Head of Marketing & Sales

Minerva Biolabs GmbH

Köpenicker Straße 325

D-12555 Berlin

Tel.: +49-(0)30-6576 2830

Fax: +49-(0)30-6576 2831

info@minerva-biolabs.com, www.minerva-biolabs.com

2. Produktname Aqua Screen ® Onar ® Lp-QP & Onar ® Ls-QP MolYsis artusTM HBV LC PCR Kit • artusTM HBV RG PCR Kit •

artusTM HBV TM PCR Kit

Die artusTM HBV PCR Kits erlauben den schnellen,

sensitiven und quantitativen Nachweis von HBV-DNA

aus EDTA-Plasma. Dies ist essentiell, um die antivirale

Behandlung von Patienten zu überwachen.

Sepsis-Diagnostik, PCR-Detektion und Identifizierung

von Bakterien in Blut und Blutprodukten. Qualitative

und/oder quantitative Analyse

3. Anwendungsgebiete Nachweis von Legionellen in Wasser Nachweis von Legionella pneumophila und Legionella

spp

Die artusTM HBV PCR Kits basieren auf dem Nachweis

eines spezifischen Abschnitts des HBV-Genoms

durch Echtzeit-PCR. Sie enthalten alle notwendigen

Reagenzien für den zuverlässigen Nachweis und die

Quantifizierung von HBV-DNA

Prä-analytischer Kit für die Nukleinsäure-basierte

Diagnostik mit Steigerung der Sensitivität, Spezifität und

Zuverlässigkeit der PCR-Analyse von Bakterien in Blut.

Onar ® Lp-QP und Onar® Ls-QP sind In-Vitro-Diagnostika

für den quantitativen Nachweis von Legionella

pneumophila bzw. Legionella spp. in klinischem Probenmaterial.

Der Assay basiert auf der Polymerase-Kettenreaktion

(PCR) und zeichnet sich durch eine extrem hohe

Sensitivität und nahezu 100%ige Spezifität aus. Minerva

Biolabs QP-Kits sind auf allen gängigen real-time-Thermocyclern

anwendbar

Aqua Screen ® ist das erste Komplettsystem zur Detektion

kultivierbarer als auch nicht-kultivierbarer

Legionellen in Wasser. Das Aqua Screen ® System

umfaßt alles: die Wasserfiltration, die DNA Extraktion

und die PCR-Diagnostik und führt so zu einer genauen

Quantifizierung der Legionellen-Genome in der Probe.

Das System bietet einen schnellen und effizienten Weg,

um den Legionellengehalt (weniger als 200 Legionellen-

Partikel pro Liter Wasser) in weniger als einem Tag zu

messen – der vollständige Prozeß dauert zwischen vier

und sechs Stunden.

4. Kurzbeschreibung des Produktes

P C R & C H I P - D I AG N O S T I K

5. Organismus/Krankheit Legionellen/respiratorische Erkrankungen Bakterielle Sepsiserreger, Bakteriämie, Sepsis Eine Infektion mit dem Hepatitis B-Virus (HBV) führt

zu allgemeinem Krankheitsgefühl mit Appetitlosigkeit,

Erbrechen und Abdominalbeschwerden. Bei 10

20 % der Infizierten treten Fieber, Exanthemen sowie

rheumatoiden Gelenk- und Muskelbeschwerden

auf. Eine fulminante akute Hepatitis tritt bei 1 % aller

Infizierten auf und endet häufig mit dem Tod. Bei 5

- 10 % aller Patienten manifestiert sich eine chronische

Leberentzündung, die zu einer Leberzirrhose

bzw. einem primären hepatozellulären Karzinom

führen kann.

Präzise Quantifizierung der HBV-DNA – durch Verwendung

der fünf mitgelieferten Standards

Zuverlässige Ergebnisse – Überprüfung von Probenvorbereitung

und erfolgreicher Amplifikation durch

eine mitgelieferte Interne Kontrolle • Hohe Sensitivität

– Analytische Nachweisgrenze zwischen 3,8 und

5,8 IU/ml • Hohe Linearität — von 9 IU/ml bis 4 x 109

IU/ml (für artusTM HBV TM PCR Kits) • Verwendbar

mit den Real-time Geräten: • LightCycler ® Instrument

• Rotor-GeneTM • ABI PRISM ® 7000, 7700, 7900HT SDS

LABORWELT 6. Jahrgang | Nr. 6/2005 | 45

Für die Isolierung reiner bakterieller DNA aus 0,2 – 0,5

ml Vollblut

6. Technische Daten

CE Label CE-zertifiziert gemäß EU-Direktive 98/79/EG

7. CE-zertifiziert/Forschungseinsatz? Nein/Wasser-Diagnostik Onar ® Lp–QP ist CE-registriert und für die klinische

Diagnostik zugelassen

Assay-Entwicklung Technical Support

Schulungen

Minerva Biolabs bietet die vollständige Legionellen-

Untersuchung von der Aufarbeitung der Wasserprobe

bis hin zu einer leicht verständlichen Auswertung und

Beurteilung der quantitativen PCR-Ergebnisse. Senden

Sie uns einfach Ihre Wasserprobe zu. Wir senden Ihnen

innerhalb von 24 Stunden nach Erhalt der Probe das

Ergebnis.

Minerva Biolabs bietet die vollständige Legionellen-

Untersuchung von der Aufarbeitung der Wasserprobe

bis hin zu einer leicht verständlichen Auswertung und

Beurteilung der quantitativen PCR-Ergebnisse. Senden

Sie uns einfach Ihre Wasserprobe zu. Wir senden Ihnen

innerhalb von 24 Stunden nach Erhalt der Probe das

Ergebnis.

8. Service

Taq DNA-Polymerase für die sensitive 16S rDNA-

Analyse (MolTaq 16S) wird mit dem Kit frei geliefert.

Kit enthält Reagenz zur Lyse von Gram-positiven und

Gram-negativen Bakterien

Minerva Biolabs QP Kits sind auf allen gängigen realtime-Thermocyclern

anwendbar

9. Extras / Besonderheiten

ab 178,- D

ab 224,- D/25 Tests

Service: nein

Real-time PCR-Diagnostik Kits ab 179,- D/25 Tests.

Service: 69,- D/Test

10. Preis (ab…Euro)


Microarray Solutions

SCHOTT Jenaer Glas GmbH

Otto-Schott-Straße 13

07745 Jena

Tel.: 49-(0)3641-681-91966

Fax: +49-(0)3641-681-970

coatedsubstrate@ schott.com

Roche Diagnostics GmbH

Sandhofer Straße 116

68305 Mannheim

Dr. Andreas Görtz

andreas.goertz@roche.com

QIAGEN Diagnostics GmbH

Königstraße 4a

22767 Hamburg

www.qiagen-diagnostics.de

Dr. Jens Dannenberg

Tel.: +49-(0)40-413647-88

jens.dannenberg@qiagen.com

1. Firmendaten, Ansprechpartner QIAGEN Diagnostics GmbH

Königstraße 4a

22767 Hamburg

www.qiagen-diagnostics.de

Dr. Sven Cramer

Tel.: +49-(0)40-413647-74

sven.cramer@qiagen.com

artus TM HFE LC PCR Kit AmpliChip CYP450-Test (CE-IVD) Nexterion ® Slide E

artusTM M. tuberculosis LC PCR Kit • artusTM M. tuberculosis

RG PCR Kit • artusTM M. tuberculosis TM PCR Kit

2. Produktname

Pharmakogenetik/Individualisierte Arzneimitteltherapie besonders geeignet für alle aminomodifizierten und

unmodifizierten Oligonukleotide • ebenfalls geeignet

für cDNA/PCR-Proben

Der artusTM HFE LC PCR Kit erlaubt den zuverlässigen

und schnellen Nachweis klinisch relevanter genetischer

Varianten des HFE-Gens in humaner DNA. Diese Analyse

ermöglicht die Abschätzung individueller Hämochromatoserisiken.

Die artusTM M. tuberculosis PCR Kits erlauben den

schnellen, sensitiven und quantitativen Nachweis der

DNA aller Mitglieder des M. tuberculosis-Komplexes

(M. tuberculosis, M. africanum, M. bovis, M. bovis BCG,

M. microti) aus Sputum, BAL, Bronchialsekret, Liquor,

Magensaft und Peritoneal-Punktat

3. Anwendungsgebiete

Die artusTM M. tuberculosis PCR Kits basieren auf dem

Nachweis eines spezifischen Abschnitts des mykobakteriellen

Genoms durch Echtzeit-PCR. Sie enthalten alle

notwendigen Reagenzien für die zuverlässige Detektion

und Quantifizierung der mykobakteriellen DNA.

4. Kurzbeschreibung des Produktes

M A R K T Ü B E R S I C H T

Die Epoxy-Oberfläche ermöglicht eine effiziente und

feste Bindung der Biomoleküle und sorgt für eine optimale

Probenpräsentation. Die Nukleinsäuren reagieren

sofort mit der Epoxy-modifizierten Oberfläche

des Glassubstrates und gehen eine feste, kovalente

Bindung ein. Die Dichte der Epoxygruppen auf der

Oberfläche ist über die gesamte Slide-Fläche konstant

und sorgt für eine optimale Bindungskapazität.

Der AmpliChip CYP450 ist der weltweit erste Microarray

mit einer Zulassung (FDA, CE) für IVD-Anwendungen.

Anhand einer Blutprobe können der CYP450 2D6 und

2C19-Genotyp und -Phänotyp bestimmt werden. Das

Analyseresultat unterstützt die individuelle Therapiefindung

und kann zu schnelleren Therapieerfolgen und

verringerten Nebenwirkungen führen.

Der artusTM HFE LC PCR Kit basiert auf dem Nachweis

der genetischen Varianten des HFE-Gens durch Echtzeit-PCR.

Die Reagenzien enthalten alle notwendigen

Komponenten zum Nachweis der genetischen Varianten

an den Nukleotidpositionen C4762G (entspricht Aminosäureposition

H63D) und G6722A (entspricht Aminosäureposition

C282Y). • Darüber hinaus ermöglicht das

artusTM HFE LC PCR Kit den Nachweis der Mutation an

der Nukleotidposition A4768T (entspricht Aminosäureposition

S65C), die durch Schmelzkurvenanalyse gut von

der Mutation C4762G (Aminosäureposition H63D) unterschieden

werden kann.

Leber/Depression, Herzinsuffizienz etc

Die hereditäre Hämochromatose (HFE) ist eine autosomal

rezessive Erbkrankheit, bei der im Körper übermäßig

viel Eisen gespeichert wird. Sind Serumferritin- und

Transferrin-Werte dauerhaft zu hoch oder gibt es in

der Familie bereits einen Hämochromatosefall, sollte

eine Untersuchung auf die relevanten HFE-Mutationen

erfolgen. Für 90 % der Hämochromatosefälle sind die

Mutationen G6722A (Aminosäureposition C282Y) und

C4762G (Aminosäureposition H63D) des HFE-Gens verantwortlich.

• Jeder zehnte Mensch in der kaukasischen

Bevölkerung trägt ein defektes Gen in sich, einer von 200

bis 400 Menschen erkrankt an Hämochromatose.

Tuberkulose ist nach wie vor eine der bedeutendsten

Infektionskrankheiten der Welt. Die Übertragung der

Erreger erfolgt durch Aerosole, wobei eine Anstekkungsgefahr

nur von Personen mit aktiver Tuberkulose

ausgeht. Im Primärstadium sind in erster Linie Teilbereiche

der Lunge und zugehörige Lymphknoten von der

Infektion betroffen. In Abhängigkeit vom Immunstatus

des Patienten kann es jedoch auch zu einer Ansiedlung

von M. tuberculosis in anderen Organen kommen.

5. Organismus/Krankheit

DX Microarray, basierend auf Affymetrix-Technologie Geometrie: 75,6 mm x 25,0 mm (± 100 µm) • Dicke:

1,0 mm (± 50 µm) ±Ebenheit: ≤ 50 µm

Prinzipiell reagieren alle nukleophilen Gruppen

(NH -, SH-, OH-) sofort und irreversibel zu eine

2

festen, kovalenten Bindung. Zusätzliche Schritte

zur Immobilisierung wie UV-crosslinking sind nicht

erforderlich. • Nexterion ® Slide E ist verpackt in

stabilen Plastikboxen zu je 25 Stück

Präzise Quantifizierung mykobakterieller DNA – durch

Verwendung der mitgelieferten Standards •Zuverlässige

Ergebnisse – Überprüfung von Probenvorbereitung

und erfolgreicher Amplifikation durch eine mitgelieferte

interne Kontrolle • Hohe Sensitivität – Analytische

Nachweisgrenze zwischen 6 und 10 Kopien/PCR (je

nach Kit) • Zugelassen für Diagnostik - CE-markiert

laut EU-Direktive 98/79/EG über In-vitro-Diagnostika •

Verwendbar mit den Real-time Geräten: • LightCycler ®

Instrument • Rotor-GeneTM • ABI PRISM ® 7000, 7700,

7900HT SDS

46 | 6. Jahrgang | Nr. 6/2005 LABORWELT

Nachweis der genetischen Varianten G6722A und

C4762G mit dem LightCycler • Die Sensitivität liegt

zwischen 10 und 55 pg/PCR.

6. Technische Daten

7. CE-zertifiziert/Forschungseinsatz? CE-zertifiziert gemäß EU-Direktive 98/79/EG CE-zertifiziert gemäß EU-Direktive 98/79/EG CE, FDA-Zulassung, IVD-Einsatz Zertifizierung nach DIN ISO 9001ff vorauss. 2. Quartal

2006

8. Service Technical Support • Schulungen Technical Support • Schulungen Affymetrix DX Technische Beratung, Tel:. +49-(0)3641-681-91969

9. Extras / Besonderheiten

10. Preis (ab…Euro) ab 450,- D ab 9,25D/St


SIRS-Lab GmbH

Winzerlaer Str. 2

07745 Jena

www.sirs-lab.de

Tel.: +49-(0)3641-508 430

Roberto C. Wolfer

SIRS-Lab GmbH

Winzerlaer Str. 2

07745 Jena

www.sirs-lab.de

Tel.: +49-(0)3641-508 430

Roberto C. Wolfer

Microarray Solutions

SCHOTT Jenaer Glas GmbH

Otto-Schott-Straße 13

07745 Jena

Tel.: 49-(0)3641-681-91966

Fax: +49-(0)3641-681-970

coatedsubstrate@ schott.com

1. Firmendaten, Ansprechpartner Microarray Solutions

SCHOTT Jenaer Glas GmbH

Otto-Schott-Straße 13

07745 Jena

Tel.: 49-(0)3641-681-91966

Fax: +49-(0)3641-681-970

coatedsubstrate@ schott.com

2. Produktname Nexterion ® HiSens Slide E Nexterion ® 70mer Oligo Microarraying Kit Looxster TM Universal Looxster TM Blood

Innovatives System zur Probenvorbereitung für

Nukleinsäure-basierte Nachweise bakterieller

Erreger aus Vollblut

Innovatives System zur Probenvorbereitung für nukleinsäure-basierte

Nachweise bakterieller Erreger in medizinischer

Forschung, Lebensmittel- und Umweltanalytik.

besonders geeignet für alle aminomodifizierten und

unmodifizierten Oligonukleotide

besonders geeignet für alle aminomodifizierten und

unmodifizierten Oligonukleotide • ebenfalls geeignet für

cDNA/PCR-Proben

3. Anwendungsgebiete

Mit LooxsterTM Blood kann bakterielle DNA aus

Blutproben angereichert werden. LooxsterTM Blood

besteht aus der Extraktion der Gesamt-DNA mit anschließender

Anreicherung bakterieller DNA. Hierzu

enthält der LooxsterTM Blood alle erforderlichen

Reagenzien und Verbrauchsmaterialien.

Mit LooxsterTM Universal kann unabhängig von der

Art der Probe bakterielle DNA angereichert werden.

Ausgehend von einer Gesamt-DNA-Präparation wird in

wenigen Wasch- und Elutionsschritten die bakterielle

DNA spezifisch angereichert. Hierzu enthält der LooxsterTM

Universal alle erforderlichen Reagenzien und

Verbrauchsmaterialien.

Kit-basierte Lösung bestehend aus Nexterion ® Slide E,

Nexterion ® 70mer Oligo Spot, Nexterion ® 70mer Oligo

Pre-Hyb, Nexterion ® 70mer Oligo Hyb, Nexterion ® 70mer

Oligo Wash A, Nexterion ® 70mer Oligo Wash B.

Somit sind die wichtigsten Schritte des Microarray-Prozesses:

Spotten, Blocken, Hybridisieren und Waschen

abgedeckt. Alle Kit-Komponenten sind aufeinander

abgestimmt und optimiert für die Verwendung von

70mer Proben von Operon, aber auch für alle anderen

Oligonukleotidproben geeignet. • Der Kit gewährleistet

eine maximale Reproduzierbarkeit der Daten, und der

Aufwand zur Protokolloptimierung wird wesentlich

verringert.

Durch die spezielle Beschichtung der Oberfläche wird

eine signifikante Erhöhung der Signalintensität erreicht

(bis zu 8mal höher im Vergleich zu konventionellen

Slides). • Die Epoxy-Oberfläche ermöglicht eine effiziente

und feste Bindung der Biomoleküle und sorgt für

eine optimale Probenpräsentation. Die Nukleinsäuren

reagieren sofort mit der Epoxy-modifizierten Oberfläche

des Glassubstrates und gehen eine feste kovalente

Bindung ein. Die Dichte der Epoxygruppen auf der

Oberfläche ist über die gesamte Slide-Fläche konstant

und sorgt für eine optimale Bindungskapazität.

4. Kurzbeschreibung des Produktes

P C R & C H I P - D I AG N O S T I K

Probenvorbereitung für den Nukleinsäure-basierten

Nachweis von bakteriellen Erregern aus Vollblut.

Probenvorbereitung für den Nukleinsäure-basierten

Nachweis von bakteriellen Erregern

5. Organismus/Krankheit

LooxsterTM Blood kombiniert effiziente Lyse auch

schwer lysierbarer Bakterien mit einer spezifischen

Anreicherung bakterieller DNA, basierend auf der

patentierten PureproveTM-Technologie LooxsterTM Universal basiert auf der patentierten PureproveTM-Technologie,

die eine spezifische Bindung

bakterieller DNA ermöglicht.

verfügbar in verschiedenen Größen (25 Slides, 100

Slides, 500 Slides)

Geometrie: 75,6 mm x 25,0 mm (± 100 µm) • Dicke: 1,0

mm (± 50 µm) • Ebenheit: ≤ 50 µm • Prinzipiell reagieren

alle nukleophilen Gruppen (NH -, SH-, OH-) sofort

2

und irreversibel zu einer festen, kovalenten Bindung. •

Zusätzliche Schritte zur Immobilisierung wie UV-crosslinking

sind nicht erforderlich. • Nexterion ® Slide E ist

verpackt in stabilen Plastikboxen zu je 25 Stück

6. Technische Daten

LABORWELT 6. Jahrgang | Nr. 6/2005 | 47

LooxsterTM Blood wird ausschließlich für die Verwendung

in Forschung und Entwicklung vertrieben.

SIRS-Lab ist zertifiziert nach DIN EN ISO 9001:2000

LooxsterTM Universal wird ausschließlich für die Verwendung

in Forschung und Entwicklung vertrieben.

SIRS-Lab ist zertifiziert nach DIN EN ISO 9001:2000

Zertifizierung nach DIN ISO 9001ff vorauss. 2. Quartal

2006

Zertifizierung nach DIN ISO 9001ff vorauss. 2. Quartal

2006

7. CE-zertifiziert/Forschungseinsatz?

8. Service Technische Beratung Tel. +49-(0)3641-681-91969 Technische Beratung Tel. +49-(0)3641-681-91969 Servicetelefon: +49-3641-508430 Servicetelefon: +49-3641-508430

Erhöhung der Sensitivität von Nukleinsäurebasierten

Nachweismethoden • Kombinierbar

mit verschiedenen Vervielfältigungsmethoden •

Gesamtsystem für die Extraktion der Gesamt-DNA

aus Vollblut mit anschließender Anreicherung

bakterieller DNA • Optimierte Methode zur Lyse

von Zellen durch Kombination von chemischen und

enzymatischen Verfahren • Effiziente Lyse auch von

schwer lysierbaren Bakterien ( z.B. Streptococcus

pyogenes) • Erfaßt die gesamte bakterielle DNA in

der Probe einschließlich DNA aus phagozytierten

und intrazellulären Bakterien sowie freie bakterielle

DNA • Anreicherung der bakteriellen DNA basiert

auf dem einzigartigen Funktionsprinzip der PureproveTM-Technologie

Erhöhung der Sensitivität von Nukleinsäure-basierten

Nachweismethoden • Ermöglicht die Anreicherung von

bakterieller DNA aus komplexen biologischen Proben •

Erfaßt die gesamte bakterielle DNA in der Probe einschließlich

DNA aus phagozytierten und intrazellulären

Bakterien sowie freie bakterielle DNA • Basiert auf der

spezifischen Bindung von nicht-methylierter DNA •

Kombinierbar mit jeder nachgeschalteten, molekularbiologischen

Nachweismethode • Unabhängig von der

Art der biologischen Probe

9. Extras / Besonderheiten

ab 559,- D für 20 Anreicherungen. Attraktiver Markteinführungsrabatt

bis 30.11.2005

394,- D für 20 Anreicherungen

824 ,- D für 50 Anreicherungen

10. Preis (ab…Euro) ab 19,- D/St ab 400,- D/St für Kit à 25 Slides mit den entsprechenden

Reagenzien


Analytik Jena Group

AJ Roboscreen GmbH

Delitzscher Strasse 135

D-04129 Leipzig

Tel.: +49-(0)341-9725970

Fax.: +49-(0)341)-9725979

Thomas Köhler

www.roboscreen.com

thkoehler@roboscreen.com

1. Firmendaten, Ansprechpartner Analytik Jena Group

AJ Roboscreen GmbH

Delitzscher Strasse 135

D-04129 Leipzig

Tel.: +49-(0)341-9725970

Fax.: +49-(0)341)-9725979

www.roboscreen.com

Thomas Köhler

thkoehler@roboscreen.com

RoboGene ® Hepatitis B Virus (HBV) Purification

& Quantification Module

RoboGene ® Bird Flu H5N1 RNA Qualitative

Purification & Detection Modules

2. Produktname

Quantitativer Direkterregernachweis anhand

des DNA-Genoms von Hepatitis B-Viren (HBV)

mittels Real-Time-Fluoreszenz-PCR in humanem

Serum/Plasma.

Qualitativer bzw. semi-quantitativen Direkterregernachweis

anhand des RNA-Genoms

von H5N1 Vogelgrippeviren mittels Real-Time

Fluoreszenz PCR in verschiedenen Untersuchungmaterialien

und Spezies

3. Anwendungsgebiete

M A R K T Ü B E R S I C H T

Test zur Reinigung und zum spezifischen

Direktnachweis von HBV-Erregern bei simultanem

Nachweis einer internen Kontroll-DNA

(Duplex-PCR)

One-step Test zur Reinigung und zum spezifischen

Direktnachweis von H5N1-Erregern bei

simultanem Nachweis einer internen Kontroll-

RNA (Duplex-PCR)

Kontakt zu Verbänden

4. Kurzbeschreibung des Produktes

5. Organismus/Krankheit Geflügel, Mensch / Vogelgrippe H5N1 Mensch / akute bzw. chronische HBV-Infektion

„Instant Buffer“-Technologie für die Probenvorbereitung,

interne DNA-Kontrolle

(synthetisches Gen) bereits stabilisiert in den

DNA-Extraktionsgefäßen enthalten, HBV-Kontroll-DNA

in Form „intelligenter“ PCR-Gefäße

(beschichtete PCR-Gefäße), TRIPLEHYB ®

Detektionsformat zum Echtzeit-Nachweis

der Amplifikationsprodukte • Kit-Versionen

für SpeedCycler, ABI/iCycler, Rotor-Gene,

LightCycler als auch SmartCycler erhältlich

• Lieferbar im Umfang 50 bzw. 100 Tests pro

Box, Lieferzeit: ca. 5-10 Tage

„Instant Buffer“-Technologie für die Probenvorbereitung,

interne RNA-Kontrolle (synthetisches

Gen) bereits stabilisiert in den RNA-

Extraktionsgefäßen enthalten, Kontroll-RNA in

Form „intelligenter“ PCR-Gefäße (beschichtete

PCR-Gefäße), TRIPLEHYB ® -Detektionsformat

zum Echtzeit-Nachweis der Amplifikationsprodukte

• Kit-Versionen sowohl für SpeedCycler,

ABI/iCycler, Rotor-Gene als auch LightCycler

erhältlich • Lieferbar im Umfang 50 bzw. 100

Tests pro Box, Lieferzeit: ca. 5-10 Tag

6. Technische Daten

V E R B Ä N D E

48 | 6. Jahrgang | Nr. 6/2005 LABORWELT

7. CE-zertifiziert/Forschungseinsatz? CE-Kennzeichnung angemeldet CE-Kennzeichnung voraussichtlich 04/2006

Einzelkomponenten Reagenz-Mix, HBV Kontroll-DNA,

Sample-Tubes separat bestellbar,

telefonischer Customer-Support, auf Nachfrage

praktisches Applikationstraining

Einzelkomponenten Reagenz-Mix, HBV Kontroll-DNA,

Sample-Tubes separat bestellbar,

telefonischer Customer-Support, auf Nachfrage

praktisches Applikationstraining

8. Service

Empfohlene Taq-DNA-Polymerase nicht im

Lieferumfang enthalten, lieferbar inklusive

kompletter HTS-Workstation (SpeedCylcer

36/96, SpeedScan PCR Endpunktreader, Fas-

Trans-Pipettierautomat)

Empfohlene RT-PCR Enzyme nicht im Lieferumfang

enthalten, lieferbar inklusive kompletter

HTS Workstation (SpeedCyler 36/96,

SpeedScan PCR Endpunktreader, FasTrans

Pipettierautomat)

Im Jahr 2005 erscheint LABORWELT zweimonatlich. Alle Abonnenten des Branchen-Magazins |transkript sowie die Mitglieder der nachfolgenden

Gesellschaften erhalten LABORWELT regelmäßig mit freundlicher Empfehlung ihrer Organisationen. Wer sich darüber hinaus für einen Beitritt interessiert,

erreicht die Gesellschaften unter folgenden Kontaktdaten:

DECHEMA

Fachsektion Biotechnologie

Theodor-Heuss-Allee 25

D-60486 Frankfurt/Main

Tel.: +49-(0)-69-7564-289

Fax: +49-(0)-69-7564-272

www.dechema.de

Deutsche Gesell. für Proteomforschung

c/o MPI für Biochemie

Am Klopferspitz 18a

D-82152 Martinsried

Tel.: +49-(0)-89-8578-3964

Fax: +49-(0)-89-8578-2802

c.kleinhammer@dgpf.org

www.dgpf.org

Österreichische Gesell. für Biotechnologie

c/o Boehringer Ingelheim

Austria GmbH

Dr. Boehringer-Gasse 5-11

A-1121 Wien

Tel.: +43-(0)-1-80105-2311

Fax: +43-(0)-1-80105-9311

www.boku.ac.at/oegbt/

Verband Deutscher Biologen

Corneliusstr. 6

D-80469 München

Tel.: +49-(0)-89-26024573

Fax: +49-(0)-89-26024574

info@vdbiol.de

www.vdbiol.de

Deutsche Gesellschaft für Genetik

c/o Genetisches Institut der

Universität Gießen

Heinrich-Buff-Ring 58-62

D-35392 Gießen

Tel.: +49-(0)-641-99-35463

Fax: +49-(0)-641-99-35469

www.gfgenetik.de

Gesellschaft für Signaltransduktion

c/o Prof. Dr. Ralf Hass

Med. Hochschule Hannover

AG Biochemie u. Tumorbiol.

D-30625 Hannover

Tel.: +49-(0)-511-532-6070

Fax: +49-(0)-511-532-6071

www.sigtrans.de

9. Extras / Besonderheiten

Nationales Genomforschungsnetz

10. Preis (ab…Euro)

c/o DLR – Koblenzerstr. 112

53177 Bonn-Bad Godesberg

Tel.: +49-(0)-228-3821-331

Fax: +49-(0)-228-3821-332

pm-ngfn@dlr.de

www.ngfn.de

Deutsche Gesellschaft für Neurogenetik

c/o Institut für Humangenetik

Uni Gießen/Schlangenzahl 14

35392 Gießen

Tel.: +49-(0)-641-99-41600

Fax: +49-(0)-641-99-41609

www.med.uni-giessen.de

/genetik/dgng.html

Netzwerk Nutrigenomforschung

Arthur-Scheunert-Allee 114

14558 Bergholz-Rehbrücke

Tel.: +49-(0)-33200 88 385

Fax: + 49-(0)-33200 88 398

verein@nutrigenomik.de

www.nutrigenomik.de


S T E L L E N M A R K T

Akademischer Stellenmarkt

Veröffentlichen Sie Ihre Stellenanzeigen zielgruppengerecht in unserem akademischen Stellenmarkt, der allen nicht-kommerziellen Instituten für ihre

Stellenausschreibungen kostenlos zur Verfügung steht. Bitte senden Sie dazu ihre Anzeige (1/4 Seite 90 mm breit x 122,5 mm hoch, Logo – jpg oder tiff, 300

dpi Auflösung) an schnell@biocom.de. Annahmeschluß für die nächste LABORWELT-Ausgabe 1/06 (Erscheinungstermin 16.02.2006) ist der 27. Januar.

Paul-Ehrlich-Institut Paul-Ehrlich-Straße 51 - 59, 63225 Langen, Telefon (06103) 77-11 00

Research activities at the Paul-Ehrlich-Institut (localized close to Frankfurt am Main) are based on the tradition of Paul Ehrlich’s work addressing questions in the fields of applied

and basic sciences. The section “Human Retroelements” of the Paul-Ehrlich-Institut has two open positions for highly motivated

International Max Planck Research School

for Molecular and Cellular Life Sciences

The International Max Planck Research School for Molecular and Cellular

Life Sciences in Munich, jointly conducted by the Max Planck Institutes

of Biochemistry, Neurobiology and Psychiatry in cooperation with the

Ludwig Maximilian University and the Technical University Munich, has

openings for,

PhD student positions

in international PhD program “Molecular and Cellular Life Sciences”

The interdisciplinary program, entirely taught in English, provides comprehensive

training and research opportunities in molecular medicine, cell

biology, neurobiology, biochemistry and structural biology. The curriculum

includes introductory courses, interdisciplinary lecture series, advanced

method courses, tutorials/seminars and training in soft skills. Participants

are expected to graduate within 3-4 years.

Highly qualified candidates with a deep commitment to basic and/or clinical

research are invited to apply. Deadline for application is January 15, 2006;

classes will commence in October 2006.

For online application and further details, please visit our website.

Contact:

H.J. Schaeffer, PhD, International Max Planck

Program Coordinator Research School for Molecular

phone: 089 8578 2281 and Cellular Life Sciences

email: info@imprs-ls.mpg.de Am Klopferspitz 18

web: http://www.imprs-ls.de/ 82152 Martinsried/Munich

PhD. STUDENTS E13/2 TVöD

The Grant-funded positions are available instantly for 3 years to study the biology of the human non-LTR retrotransposon SVA and the human endogenous retrovirus HERV-K. SVA

elements are fairly active and mobile in the human genome and closely related to the human LINE-1 retrotransposon, a major force shaping the human genome. SVAs and HERV-

K play an important role in genetic evolution and in the formation of genetic disorders and cancer. The projects to be worked on include: analysis of organization, structure and

evolution of SVA elements in the genomes of the primate /human lineage, characterization of the mechanism of SVA mobilization, identification of cis acting sequences and trans

acting factors controlling SVA and HERV-K transcription, epigenetic modifications involved in the regulation of retrotransposons, impact of HERV-K activation in cancer. For further

information see our website www.pei.de or contact Dr. Roswitha Löwer (06103/77-3400, loero@pei.de) and PD Dr. Gerald Schumann (06103/77-3105, schgr@pei.de).

Candidates should hold a diploma or equivalent degree in Biology, Biochemistry or Chemistry and should have a strong background in molecular biology, cell biology and/or

genetics. Applications should include a detailed CV, copies of relevant documents and a brief description of research interests.

The annual salary of approximately 18.000 Euro before taxes and insurance will be in accordance with the -“Tarifvertrag öffentlicher Dienst”- (TVöD).

Non-residents will receive assistance in finding accommodation. Relocation expenses and/or a special allowance for living away from your present place of residence will be

paid in compliance with the legal regulations. Disabled applicants will be given preference over non-disabled competitors if their expertise and qualifications are equal. The

Paul-Ehrlich-Institut is an equal opportunity employer and women are encouraged to apply for this position.

Please send your application including a detailed CV, photo, a short summary of your professional career, and copies of your professional certificates to the “Personalreferat

des Paul-Ehrlich-Instituts”, Paul-Ehrlich-Str. 51-59, 63225 Langen, Germany (personal@pei.de). Closing date: 24. November 2005

Stellenausschreibung Nr. 38/2005 an der Bayerischen Landesanstalt für Landwirtschaft

– Institut für Pflanzenbau und Pflanzenzüchtung – Arbeitsbereich Genomanalyse (IPZ

1b) in Freising-Weihenstephan, ist im Rahmen eines DFG-Kooperationsprojektes

ab Frühjahr 2006 eine Stelle als

wissenschaftliche/r Mitarbeiter/in (Doktorand/in)

zu besetzen. Die Bezahlung erfolgt nach Vergütungsgruppe IIa/2 BAT.

Die Stelle ist vorerst auf 2 Jahre befristet.

Forschungsvorhaben: Fusarium-Resistenz von Winterweizen (Triticum aestivum):

Entwicklung und Kartierung funktioneller genetischer Marker mit Hilfe eines integrativen

Ansatzes von Expressions- und Kandidatengenanalyse auf der Basis einer

validierten QTL-Karte

Aufgabenschwerpunkte:

– Etablierung eines Infektionssystems zur Untersuchung differentieller Genexpression

während der Weizen-Fusarium-Interaktion.

– Identifizierung und Analyse differentiell exprimierter Gene mittels cDNA-

AFLP- Technik, quantitativer PCR und Northern Blots.

– Entwicklung molekularer Marker aus differentiellen cDNA-Fragmenten.

– QTL-Kartierung der funktionellen Marker in die bestehenden Populationen.

– Berechnung von Marker-Merkmal-Assoziationen.

Hierfür setzen wir folgende Qualifikationen und Fähigkeiten voraus:

– Abgeschlossenes Hochschulstudium der Agrar- oder Biowissenschaften

oder ähnliche Qualifikation, die zur Promotion berechtigt.

– Kenntnisse und Interesse an molekularbiologischen Methoden, insbesondere

auf dem Gebiet der Expressionsanalyse (RNA-Präparation, cDNA-Synthese,

RT-PCR) sowie an molekularen Markertechniken (AFLP, STS, SNP)

– Fähigkeit zum wissenschaftlichen Arbeiten.

– Erfahrungen mit statistischer Versuchsauswertung.

– Engagement, Flexibilität und Teamfähigkeit.

Ihre aussagekräftige Bewerbung richten Sie bitte – gerne auch per E-Mail – mit

Angabe der Stellenausschreibungsnummer – bis spätestens 20.12.2005 - an:

Bayerische Landesanstalt für Landwirtschaft, Sachgebiet AZV 2 „Personal“

Vöttinger Straße 38, 85354 Freising-Weihenstephan

E-Mail: angelika.kleinschmidt@LfL.bayern.de

Ansprechpartner im Institut: Hr. Dr. Schweizer - Tel. 08161/714065

Fr. Dr. Mikolajewski - Tel. 08161/714817

LABORWELT 6. Jahrgang | Nr. 6/2005 | 49


Kennziffer 27 LW 06 · www.biocom.de

Micro-Wippenventil

mit Medientrennung

Mit einem Leichtgewicht (9 Gramm) im Rastermaß

10 mm und herausragenden Eigenschaften

im Fluid-Handling hat Asco/Joucomatic

seine Palette von Micro-Magnetventilen

erweitert. Der spezielle MICRO-Wippenmechanismus

sorgt für höchste Sicherheit in

den sensiblen Einsatzbereichen der Analyse-,

Bio- und Medizintechnik.

Die medienberührten Teile der neuen Baureihe

067 bestehen aus hochwertigen Materialien

wie PEEK (Gehäuse) und FFKM

(Membran).

Optimale Selbstentleerung, geringstes

Innenvolumen (13 µl), sehr gute Spülbarkeit,

dazu die Medientrennung zum Magnetantrieb

sind die besonderen Eigenschaften des

Magnetventils. Der Einsatzbereich sind flüssige

und gasförmige, hochreine und aggressive

Medien, im Druckbereich von Vakuum -0,9

bar bis 3 bar. Das Ventil ist in den Nennweiten

0,6 – 0,8 – 1,0 und 1,35 mm lieferbar.

Mit der geringen Leistungsaufnahme über

eine Power-Save-Elektronik ist auch ein Batteriebetrieb

möglich. Der spezielle Wippenmechanismus

in Verbindung mit der Trennmembran

unterbindet den Wärmeeintrag

in das Medium und verhindert zusätzlich

den Klebeeffekt am Ventilsitz. Somit ist ein

sicheres Öffnen und Schließen sichergestellt.

Alle gängigen Steckeranordnungen, horizontal

und vertikal mit Kontaktabständen von

2,54 mm und 5,08 mm sowie Kabellitzen, sind

als Standard lieferbar.

Bei den 2- und 3-Wegemagnetventilen können

vielfältige Anschlußvarianten ausgewählt

werden: Gewinde M5 und UNF, Schlauchtülle,

Blocklösungen und spezielle kundenspezifische

Variationen.


P R O D U K T W E L T

Kennziffer 28 LW 06 · Informationen ordern? · www.biocom.de

Aufreinigung genomischer DNA aus großen Volumina

Mit Tecans Freedom EVO gDNA XL aufgereinigte

genomische DNA (gDNA) kann direkt

in Anwendungen wie Genotyping, Genom-

Analysen oder PCR-Reaktionen eingesetzt

werden. Die genomische DNA kann aus

frischem, gekühltem oder auch gefrorenem

Vollblut extrahiert werden. Dazu werden die

Reagenzien vom Promega MagneSil Genomic

Large Volume System auf der Freedom EVO-

Plattform verwendet.

Der Freedom EVO gDNA XL ist ein leistungsfähiges,

vollautomatisches System zur

Aufreinigung von gDNA in Primär-Röhrchen,

ohne daß zusätzliche manuelle Schritte

notwendig sind. Das System erkennt das

Probenvolumen automatisch und skaliert die

benötigten Reagenzien entsprechend, ohne

zusätzliche Programmierschritte. Der Free-

Kennziffer 29 LW 06 · Informationen ordern? · www.biocom.de

Instrument für die Pharmakogenomik in der Psychiatrie

Roche und die Mayo-Klinik entwickeln

gemeinsam den Prototypen eines IT-fähigen

Systems, mit dem das umfassende klinische

Know-how der Mayo-Klinik auf dem Gebiet

der Psychiatrie und der Pharmakogenomik

verfeinert und ausgeschöpft werden kann.

Das System nutzt dabei Patientendaten, die

mit dem AmpliChip CYP450-Test ermittelt

wurden. Es ist Roche Diagnostics’ erster

Diagnosetest auf Biochip-Basis, der im Januar

2005 von der FDA für die diagnostische Anwendung

in den USA zugelassen wurde.

Kennziffer 30 LW 06 · Informationen ordern? · www.biocom.de

Neues Nukleinsäure-Präparationssystem QuickGene-610

Fujifilms erfolgreiche Serie an Nukleinsäure-

Präparationssystemen wird um das Quick-

Gene-610 erweitert. Aus größeren Probenmengen

kann jetzt schnell und automatisch

hochreine Nukleinsäure mit noch größerer

Ausbeute präpariert werden.

Gegenüber den bisherigen Systemen

QuickGene-800 und QuickGene-810 läßt

QuickGene-610 das zehnfache Ausgangsvolumen

zu. Während die anderen Fujifilm-Systeme

DNA aus maximal 200 µl Probenvolumen

extrahieren, kann das neue Gerät bis zu

2 ml Blut verarbeiten. QuickGene-610 besteht

neben dem platzsparenden Tischgerät aus

einem passenden Kit zur Nukleinsäure-Isolierung.

Mit dem QuickGene DNA-Vollblut-Kit

S können sechs 2-ml-Proben in nur wenigen

dom EVO gDNA XL kann unbeaufsichtigt

betrieben werden und macht Zentrifugationsschritte

und organische Lösungsmittel

überflüssig. Gerätegröße, Software und Protokolle

sind skalierbar. Proben von 1 bis 10 ml

können einzeln oder in Chargen mit einer bis

96 Proben abgearbeitet werden.

Der auf der DNA-Chip-Technologie von Affymetrix

basierende Test erlaubt eine Analyse

des Genotyps der Cytochrom-P450-2D6- und

-2C19-Gene in der genomischen DNA aus

Blutproben von Patienten.

Die Testresultate gestatten es Ärzten,

bei der Wahl und Dosierung von Medikamenten

zur Behandlung verschiedener

häufiger Krankheiten wie Herzerkrankungen,

Schmerz und Krebs die für Patienten

charakteristische genetische Information zu

berücksichtigen.

Minuten verarbeitet werden. Damit sind

deutlich mehr Anschluß-Tests und -analysen

möglich. Zu geringe Ausgangsmengen für

die Untersuchung des Erbguts stellen kein

Problem mehr dar.

50 | 6. Jahrgang | Nr. 6/2005 LABORWELT




P R O D U K T W E L T

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Kompakt-System zur Zellkultivierung in Spinner-Flaschen

Cellspin von Integra Biosciences ist ein

kompaktes Steuersystem zum Rühren von

Zellkulturen mit 100 bis 1.000 ml Volumen

und Rührgeschwindigkeiten von 5 bis

75 U/min. Das System besteht aus einer

feuchtigkeitsresistenten Rühreinheit und

einer abnehmbaren Steuereinheit. In bis zu

vier Spinnerflaschen gleichzeitig sorgt jede

Cellspin-Rühreinheit für einen schonenden

Kultivierungsprozeß. Die Cellspin-Flaschen

bieten ein vorteilhaftes Oberfläche-zu-Volumen-Verhältnis

und garantieren so einen erhöhten

Sauerstoffeintrag gegenüber anderen

gängigen Modellen. Die Standsicherheit der

Flaschen wird unabhängig von ihrer Größe

durch eine fixierende Ausbuchtung gewährleistet.

Die Steuereinheit mit Permanentspeicher

ermöglicht eine Vorprogrammierung

Kennziffer 32 LW 06 · Informationen ordern? · www.biocom.de

Kontinuierliches Dispensieren in Mikrotiterplatten

Thermo Electron hat seine Multidrop ® Dispenser-Serie

durch den neuen Multidrop

Combi erweitert. Er basiert auf der zuverlässigen

Multidrop-Technologie und bietet

höhere Flexibilität, um den Anforderungen an

die Reagenzienausgabe in pharmazeutischen

und biotechnischen Laboren zu entsprechen.

Der Multidrop Combi arbeitet mit allen Standard-Plattenformaten

(96-1.536) und paßt die

Plattenhöhe automatisch an. Hohe Präzision

über den Volumenbereich von 0,5 – 2.500 µl

garantiert reproduzierbare Ergebnisse.

des kompletten Kultivierungsprozesses. Einstellbar

sind die automatische Anpassung der

Rührgeschwindigkeit, der Drehwinkel sowie

die Intervallpausen und Arbeitszeiten.

So können auch empfindliche Zellinien sicher

kultiviert werden. Cellspin ermöglicht

dadurch sehr hohe Expressionsraten. Zwei

Cellspin-Systeme passen bequem in einen

herkömmlichen Brutschrank.

Einfache Ansteuerbarkeit und Schnelligkeit

erleichtern die Integration in automatischen

Hochdurchsatz-Systemen. Zusammen mit

dem RapidStak-Stapler von Thermo bildet

der Multidrop Combi die zuverlässigste

Bench-Top-Automatisierungslösung für das

Dispensieren in Mikrotiterplatten.

Die moderne graphische Benutzeroberfläche

vereinfacht, Abgabeparameter zu

wählen. Der Multidrop Combi kann sowohl

Flüssigkeiten verschiedener Viskositäten als

auch lebensfähige Zellen dispensieren.

Kennziffer 33 LW 06 · Informationen ordern? · www.biocom.de

Neues automatisches Gel-Dokumentationssystem

Berthold Technologies bietet mit dem

NightHAWK LB 984 ein neues Gel-Dokumentationssystem,

das mit einer vollautomatischen

digitalen CCD-Kamera ausgestattet

ist. Hohe Auflösung, Zoomfunktion und ein

Objektiv mit einem großen Brennweitenbereich

stehen für die hervorragende Qualität

des Geräts. Die Kamera wird von der leicht

zu bedienenden HAWKview-Software

kontrolliert, die vielfältige Funktionen zur

Bildverarbeitung und Auswertung bietet.

Die Bilder werden als JPEG- oder TIFF-Daten

in einer integrierten Datenbank gespeichert.

Transilluminatoren sind in verschiedenen

Wellenlängen verfügbar (UV bis Blaulicht).

Mit den drei neuen Amphi-Farbstoffen

für die Protein-Elektrophorese und dem

NightHAWK-Gel-Dokumentationssystem

bietet Berthold Technologies eine komplette

Lösung für jeden Proteomforscher.

LABORWELT 6. Jahrgang | Nr. 6/2005 | 51



Kennziffer 34 LW 06 · www.biocom.de

Flexibles EC-Hochleistungs-

Detektionssystem

Die elektrochemische Detektion ist der anerkannte

Standard für die hochempfindliche

und selektive Detektion in der HPLC. In

Verbindung mit ESA Biosciences’ patentierten

Elektroden ist der Coulochem III der einzige

EC-Detektor, der Redox-Funktionen in einer

einzelnen Zelle anbietet. Der mit allen HPLC-

Säulen kompatible Coulochem III bietet

die größte Vielfalt von Betriebsarten und

quantifiziert Pikogramm- bis Femtogramm-

Mengen von oxidier- oder reduzierbaren neurochemischen,

klinischen, pharmazeutischen,

Umwelt- und biologischen Verbindungen

innerhalb kürzester Zeit.

Moderne Elektronik ermöglicht dem Coulochem

III eine große Stabilität und sehr

niedrige Nachweisgrenzen. Darüber hinaus

ist das Integrated Organiser Module des

Coulochem III sehr platzsparend und bietet

eine geschützte, temperaturstabilisierte Umgebung

für Säulen und Zellen.

Kennziffer 35 LW 06 · www.biocom.de



Global Supplier Award 2005

YMC Co., Ltd. wurde mit dem 2005 Global

Supplier Award der Eli Lilly and Company

ausgezeichnet. YMC gilt als einer der führenden

Anbieter von Kieselgel-Trägermaterialien

für die industrielle HPLC sowie Analyse von

pharmazeutischen Wertsubstanzen. Neben

Packungsmaterialien stellt YMC analytische

HPLC-Säulen her sowie Glassäulen und Geräte/Anlagen

für die präparative Aufreinigung

von pharmazeutischen Substanzen. Ebenso

werden Auftragssynthesen und Methodenentwicklungen

durchgeführt.


Kennziffer 36 LW 06 · www.biocom.de


„Premier Application“-Status

Affymetrix Inc. hat das ArrayPlex-System von

Beckman Coulter Inc. zur „Premier Application“

für die automatisierte Ziel-RNA-Präparation

erklärt. Dadurch kann Beckman Coulter

sein automatisches ArrayPlex-System nun

auch an Affymetrix-Kunden vertreiben.

Um sich für diesen Vorrangstatus zu qualifizieren,

stellte Beckman Coulter unter

Beweis, daß es die hohen Qualitätsanforderungen

von Affymetrix erfüllen kann. ArrayPlex

ist ein schlüsselfertiges System, das

mit automatisierten Instrumenten, Software

und Protokollen auf der Biomek FX-Liquidhandling-Workstation

arbeitet. Das Biomek

FX-System ermöglicht die automatische

Durchführung nahezu aller Forschungsanwendungen,

einschließlich der Vorbereitung

von Proben für genetische Analysen.

Kennziffer 37 LW 06 · www.biocom.de

G Storm-Thermocycler

Die neuen G Storm-Thermocycler von GRI

Ltd. im Vertrieb der AlphaMetrix Biotech

GmbH verbinden herausragende thermische

Eigenschaften mit einfacher Handhabung.

Ein farbiger Touchscreen mit selbsterklärender

Bedienungsoberfläche macht das

Programmieren, das File-Management und

die Kontrolle des Cyclers so einfach wie nie

zuvor. Hier kann zwischen der geführten

manuellen Eingabe von neuen oder bereits

ausgearbeiteten Programmen oder der

Nutzung des Programm-Wizards gewählt

werden. Die Annealingtemperaturen und die

dazugehörigen Zeiten werden in Abhängigkeit

der Benutzervorgaben berechnet. Jeder

Thermoblock des Cyclers hat vier unabhängige

Temperaturkontroll-Sensoren und acht

Peltierelemente. Zur Optimierung von Protokollen

ist die Gradientenprogrammierung

für alle Blöcke Standard. Gradienten können

zwischen 40 und 300 Grad variieren.


P R O D U K T W E L T

Kennziffer 38 LW 06 · Informationen ordern? · www.biocom.de

Präzise Werkzeuge verbessern PCR-Ergebnisse

Auch bei PCR-Verbrauchsmaterialien kommt

es auf die Qualität der Produkte an. Unterschätzt

wird dabei oft die Qualität der eingesetzten

Arbeitsmittel. Um nämlich qualitativ

hochwertige PCR-Produkte zu fertigen, ist es

einfach nötig die Anforderungen der Anwender

und die Anwendung an sich zu kennen.

Deshalb werden PCR-Produkte von SLG ®

von Molekularbiologen für Molekularbiologen

in einer aufwändigen und hochpräzisen

Produktionsanlage gefertigt. Das umfaßt den

Einsatz erstklassiger Rohmaterialien ebenso

wie präzise Werkzeuge und kontrollierte

Fertigungsabläufe. Selbstverständlich sind

alle PCR-Produkte RNase- und DNase-frei

Kennziffer 39 LW 06 · Informationen ordern? · www.biocom.de

RNeasy ® Plus Mini-Kit mit gDNA Eliminator-Säulen

Der RNeasy Plus Mini-Kit von Qiagen verbindet

eine schnelle und einfache RNA-Aufreinigung

in weniger als 25 Minuten mit der

effektiven Abtrennung aller Verunreinigungen

durch genomische DNA. Der Kit eignet sich

für tierische Zellen sowie leicht aufzuarbeitende

Gewebe und erzeugt aufgereinigte

RNA, die besonders für hochempfindliche

nachgeschaltete Anwendungen geeignet ist,

wie für die quantitative Real-time-RT-PCR.

Verunreinigungen durch genomische DNA

werden wirksam durch die Verwendung der

gDNA Eliminator-Spinsäulen im Zusammenspiel

mit optimierten Lysepuffern verhindert.

Die Zell- oder Gewebelysate werden dabei

sowie frei von Metallen und Pyrogenen. So

entstehen hochwertige Produkte von gleichbleibender,

verläßlichen Qualität.

durch die Spinsäulen zentrifugiert, welche

schnell und hochselektiv die genomische DNA

aus den Lysaten abtrennen. Eine zeitraubende

DNase-Behandlung ist damit überflüssig.

Die Kombination von Buffer RLT Plus und

RNeasy-Spinsäulen führt so zu hohen und reproduzierbaren

Gesamt-RNA-Ausbeuten. Der

Puffer sorgt dabei für optimale Lysebedingungen,

um die Freisetzung der gesamten RNA in

der Probe zu gewährleisten. RNeasy-Spinsäulen

binden die RNA mit hoher Affinität, so daß

Verunreinigungen vor der Elution wirksam

von der Säule gewaschen werden können. Das

Erzielen von hohen Agilent RIN-Werten deutet

dabei auf hochgradig intakte RNA.

Kennziffer 40 LW 06 · Informationen ordern? · www.biocom.de

Flexibles RiOs 3 für Umkehrosmose-Wasser

Millipores RiOs 3-Wasseraufbereitungssystem

wurde für Anwendungsbereiche mit einem

täglichen Bedarf von 30 Litern hochreinem

Leitungswasser konzipiert. Es bedient unkritische

Laboranwendungen wie das Waschen

von Hand oder die Pufferbereitung. Darüber

hinaus kann es auch als Brauchwasserbereiter

für Laborgerätewascher, Autoklaven und

Luftbefeuchter oder als Vorstufe für Reinstwassersysteme

wie Millipores Synergy ® - und

Milli-Q ® -Systeme dienen.

Das RiOs 3 ist als Tischgerät oder mit

Wandhalterung erhältlich. Bei 20° C liefert

das Gerät 3 l Typ-III-Umkehrosmose-Wasser

pro Stunde. Das Wasser kann nach Bedarf

verwendet werden oder in einem 6 l fassenden

Zwischentank gespeichert werden.

Die halbjährliche Wartung beschränkt sich auf

den Austausch der SmartPak -Patrone, welche

die Umkehrosmose-Membran enthält.

52 | 6. Jahrgang | Nr. 6/2005 LABORWELT




LABORWELT

INFOSERVICE


+49 (0)30 26 49 21-11

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ab ins Fax! Ihre gewünschten Infos kommen umgehend.

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� 21LW 06 � 33LW 06 � 45LW 06 � 57LW 06

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INFOSERVICEFax

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Institution: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Anschrift: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Tel./Fax: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Auch im Internet unter www.biocom.de


Impressum

LABORWELT (ISSN 1611-0854)

erscheint zweimonatlich im Verlag der

BIOCOM AG

Stralsunder Str. 58-59

D- 13355 Berlin

Tel./Fax: 030/264921-0 / 030/264921-11

eMail: laborwelt@biocom.de

Internet: www.biocom.de

Redaktion:

Dipl.-Biol. Thomas Gabrielczyk

Tel.: 030/264921-50

Anzeigenleitung:

Oliver Schnell

Tel. 030/264921-45, eMail: schnell@biocom.de

Leserservice:

Angelika Werner

Tel. 030/264921-40

Bildtechnik und Layout:

Heiko Fritz

Graphik-Design:

Michaela Reblin

Druck

Mayer & Söhne, D- 86551 Aichach

Mitglieder der DECHEMA-Fachsektion

Biotechnologie, der Österreichischen

Gesellschaft für Biotechnologie ÖGBT, der

Gesellschaft für Genetik GfG, der Deutschen

Gesellschaft für Proteomforschung DGPF,

des Verbandes Deutscher Biologen

vdbiol, der Deutschen Gesellschaft für

Neurogenetik DGNG, der Gesellschaft für

Signaltransduktion STS, des Vereins zur

Förderung der Nutrigenomforschung,

der Biotechnologischen Studenteninitiative

e.V. (btS) sowie die Wissenschaftler des

Nationalen Genomforschungsnetzes NGFN

erhalten die Zeitschrift im Rahmen ihrer

Mitgliedschaft.

Für einen regelmäßigen Bezug von

LABORWELT ist eine kostenlose

Registrierung unter www.biocom.de oder per

Fax (siehe Seite 53) erforderlich.

Namentlich gekennzeichnete Beiträge

stehen in der inhaltlichen Verantwortung der

Autoren. Alle Beiträge sind urheberrechtlich

geschützt. Ohne schriftliche Genehmigung

der BIOCOM AG darf kein Teil in irgendeiner

Form reproduziert oder mit elektronischen

Systemen verarbeitet, vervielfältigt oder

verbreitet werden.

Diese Ausgabe enthält eine Beilage der

Promega GmbH

© BIOCOM AG, Berlin

® BIOCOM ist eine geschützte Marke der

BIOCOM AG, Berlin

BIOCOM ® AG

S E R V I C E

19.-20.11.05: NGFN-Meeting 2005, Bonn

Info: Projektmanagement NGFN

(Tel./Fax: +49-228-3821-331/-332),

eMail: pm-ngfn@dir.de,

Web: www.science.ngfn.de)

20.-23.11.05: 43. Tutzing-Symposium:

Membranen und regenerative Medizin, Tutzing

Info: Dr. Karin Tiemann, DECHEMA e.V., Frankfurt a. M.

(Tel.: +49-69-7564-221, eMail: tiemann@dechema.de,

Web: www.dechema.de)

21.-22.11.05: Workshop: Monitoring von

klinischen Prüfungen, Heidelberg

Info: Monika Häring, FORUM, Institut für Management GmbH,

Heidelberg (Tel.: +49-6221-500-640,

eMail: m.haering@forum-institut.de,

Web: www.forum-institut.de)

21.-23.11.05: 7. Symposium Natural Attenuation

und 2. Statusseminar des BMBF-Förderschwerpunktes

KORA, Frankfurt am Main

Info: Sabine Sporleder, Dechema e.V., Frankfurt/M.

(Tel./Fax: +49-69-7564-129-235/-176,

Web: www.dechema.de)

22.11.05: IT-Konzepte und -Lösungen im

Life Sciences-Bereich, Berlin

Info: Sun Microsystems GmbH (Tel.: +49-2102-4511-0,

Fax: +49-2102-4995-16, Web: www.sun.de)

22.11.05: InnoPlanta Forum 2005, Magdeburg

Info: (eMail: info@innoplanta.com, Web: www.innoplanta.com)

23.-24.11.05: BioNanoMaT –

Bioinspired Nanomaterials for Medicine and

Technologies, Marl

Info: M. Neumann, DECHEMA e.V., Frankfurt/M.

(Tel.: +49-69-7564-254, eMail: neumann@dechema.de,

Web: www.dechema.de)

24.-25.11.05: 2. Glycan-Forum, Berlin

Info: Dr. Gesche Harms, Charité Universitätsmedizin Berlin

(Tel./Fax: +49-30-8445-1548/-1541,

eMail: glycanforum@charite.de, Web: www.glyconet.de)

24.11.05: Vom Laborversuch zur

Herstellungserlaubnis, Hamburg

Info: TuTech Innovation GmbH

(Tel./Fax: +49-40-76629-6346/-6349,

eMail: lifescience@tutech.de,

Web: www.tutech.de/qz)

24.11.05: Drug Development – Academia –

Biotech – Pharma, Würzburg

Info: Bayern Innovativ GmbH

(Tel./Fax: +49-911-20671-140/-766)

eMail: lifescience@bayern-innovativ.de,

Web: www.bayern-innovativ.de)

25.11.05: Festkolloquium anläßlich der Überreichung

des DECHEMA-Preises 2005 der Max-

Buchner-Forschungsstiftung, Frankfurt am Main

Info: DECHEMA e.V., Frankfurt/M.

(Tel.: +49-69-7564-375,

eMail: kolloquien@dechema.de,

Web: www.dechema.de/kolloquien)

30.11.-01.12.05: EuroPLX 26 – Vereinbarungen

über Kollaborationen bei Dossiers, Lohnsynthese

und -herstellung, F&E-Dienstleistungen sowie

Aktiven Pharmazeutischen Wirkstoffen (APIs),

Porto (P)

Info: RauCon.Com, Dielheim

(Tel./Fax: +49-6222-980-70/-777,

eMail: europlx@raucon.com,

Web: www.europlx.com)

30.11.05: Neue molekularbiologische Ansätze in

der onkologischen Forschung, Mannheim

Info: Dr. Birgit Stadler, Universität Heidelberg

(Tel.: +49-6221-54-7815,

eMail: stadler@uni-hd.de,

Web: www.afw.uni-hd.de)

01.12.05: German Biotech goes Wertschöpfung,

Frankfurt am Main

Info: GDCh, Vereinigung Chemie & Wirtschaft

(Tel./Fax: +49-69-619-942-73/-49,

eMail: hb@holgerbengs.de,

Web: www.gdch-chemiewirtschaft.de

02.12.05: Germany and Europe –

Partnership in regenerative Medicine, Berlin

Info: Ulrike Schwemmer, Dt. Ges. für Regenerative Medizin e.V.

(Tel.: +49-69-619-951-19,

eMail: info@gesellschaft-regenerative-medizin.de,

Web: www.gesellschaft-regenerative-medizin.de)

2.12.-3.12.05: 21. Ernst-Klenk-Symposium in

Molecular Medicine Atherosclerosis:

Mediators, Mechanisms and Interventions, Köln

Info: Dr. Großkopf-Kroiher, Zentrum für Molekulare Medizin,

Universität Köln, (Tel./Fax: +49-221-478-5552/-4833,

Web: www.zmmk.uni-koeln.de/klenk_2005/program

05.-06.12.05: 2. Statusseminar ChemBioNet,

Frankfurt am Main

Info: Renate Strauss/Barbara Feißt, DECHEMA e.V.

(Tel./Fax: +49-69-7564-333/-44,

Web: www.dechema.de)

07.-11.12.05: Workshop on Cell Biology &

Microscopy for PhD-students and young

Postdocs, Grünstadt an der Weinstraße

Info: (eMail: diekmann@imb-jena.de, Web: www.imb-jena.de)

08.12.05: Homogene Katalyse an festen Phasen:

Biomimetische Katalysatoren, Katalysatorrecyclierung

und enantioselektive Katalyse,

Frankfurt am Main

Info: DECHEMA e.V., Frankfurt/M.

(Tel./Fax: +49-69-7564-375/-272,

eMail: kolloquien@dechema.de,

Web: www.dechema.de/kolloquien)

08.12.05: Mit Biotechnologie wieder zur Apotheke

der Welt, Dresden

Info: biosaxony (Tel./Fax: +49-351-7965-105/-110,

eMail: jurke@biosaxony.com, Web: www.biotop.de/termine)

12.-14.12.05: 7. Dresdner Sensor-Symposium,

Dresden

Info: Prof. Dr. J.P. Baselt, Forschungsgesellschaft für

Meßtechnik, Sensorik und Medizintechnik c/o Dechema

(Tel.: +49-69-7564-227,

eMail: strauss@dechema.de,

Web: www.dechema.de)

19.01.06: Simulation zur Analyse und Optimierung

von Bioprozessen, Frankfurt am Main

Info: DECHEMA e.V., Frankfurt/M.

(Tel.: +49-69-7564-375, eMail: kolloquien@dechema.de,

Web: www.dechema.de/kolloquien)

19.01.06: Deutschland – Gentechnologisches

Entwicklungsland?, Berlin

Info: Berlin-Brandenburgische Akademie der Wissenschaften

(Tel./Fax: +49-30-20370-0/-600,

eMail: bbaw@bbaw.de,

Web: www.bbaw.de)

30.-31.01.06: Sichere Zulassung bei der FDA,

Düsseldorf

Info: Pharmaceutical Training Institute (PTI)

(Tel./Fax: +49-6196-585-131/-485,

eMail: anmeldung@iir.de,

Web: www.pti-aktuell.de)

13.-14.02.06: Seminar: Grundlagen der

Fermentation, Freising

Info: Prof. Dr. Franz Thurner, FH Weihenstephan/Fachbereich

Biotechnologie (Tel.: +49-08161-714059/-715116,

eMail: franz.thurner@fh-weihenstephan.de,

Web: www.fh-weihenstephan.de)

Kennziffer 25 LW 06 · www.biocom.de �

54 | 6. Jahrgang | Nr. 6/2005 LABORWELT


T H I R D A N N U A L B I O L O G I C A L S M A N U F A C T U R I N G S U M M I T

Biologicals Manufacturing

22-23 November 2005, London, England

Register your interest by visiting: www.bio-events.com

ViB events are proud to announce our forthcoming conference on Biological

Manufacturing due to be held in London in November this year. We have built

upon the success of the previous conference and this time we have included

more case study presentations and more roundtable discussions to make it the

best ever conference to date.

We have continued to source the most experienced speakers in the industry to

share their thoughts and ideas with you over the two days. Our expert panel of

speakers include:

� Dr Tony Bradshaw, Bioprocessing Industry Development Director, BIOINDUSTRY

ASSOCIATION (UK)

� Stephanie Schnicke, PhD, Manager, Technical Regulatory Affairs, Pharmaceutical

Biotech Production and Development, ROCHE DIAGNOSTICS

� Dr Steve Berezenko, Director of Research and Development, DELTA BIOTECHNOLOGY

� Dr Klaus Kaiser, Manager for Downstream Processing of Antibodies, BAYER

HEALTHCARE

� Simon Rothen, COO, BERNA BIOTECH

� Christian Hofmann, Ph. D., Chief Scientific Officer, APIT LABORATORIES

� Dr. Juergen Frevert, Chief Scientific Officer, BIOTECON THERAPEUTICS

� Steffen Goletz, CEO, GLYCOTYPE

� Harry Boelens Ph.D., Director DSP Large Scale-1 (DSP LS-1), DIOSYNTH

BIOTECHNOLOGY EUROPE

Some of the topics our experts will cover during the two-days are:

� Manufacturing challenges in the production of cancer vaccines

� Technology transfer

� Stability and Formulation Issues in the Manufacture of Recombinant Albumin

� Current trends in downstream processing

� The use of disposables in biologicals production

� GlycoEngineering and Glycoprofiling of cells and cell lines

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+44 207 753 4268. Or you can simply choose the following methods:

� Calling our Customer Services team on +44 (0) 20 7753 4201

� Register your interest at: www.bio-events.com

� Email us at: events@vibevents.com

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New England Biolabs

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