PDF Download - Laborwelt

Proteinkinasen-Expression. Derzeit herrscht
akuter Mangel an Antikörpern gegen einen
Großteil der Kinasen. Dieser Engpaß soll
im Rahmen des Projektes mit Hilfe der
HuCAL ® -Technologie von Antibodies by
Design behoben werden – bis zu 270 neue
Antikörper gegen Proteinkinasen sollen entwickelt
werden. Zur gezielten Blockierung
der Expression ausgewählter Proteinkinasen
kommen short-interfering RNAs (siRNAs)
zum Einsatz, die durch rekombinante Vektoren
endogen exprimiert werden. Erfolg oder
Mißerfolg des Abschaltens der gewünschten
Proteinkinasen wird dann mit Hilfe der Kinase-spezifischen
Antikörper für jedes einzelne
siRNA-Konstrukt von ProQinase und dem
NMI überprüft.
Der ASK-Chip
Beim ASK-Chip (Adenoviraler siRNA Kinom
Chip) handelt es sich um einen neuartigen
Zellchip, der durchsatzfähige zelluläre
Systeme mit endogen exprimierter siRNA
verknüpft.
Methode
Auf einem Glasträger werden infektiöse
rekombinante Adenoviren in Form eines
Microarrays immobilisiert, die die Erbinformation
funktionell validierter shRNA-
Sequenzen tragen. Auf solchen adenoviralen
Arrays ausgesäte Zellen werden spezifisch
auf den Spots durch Wechselwirkung mit
den immobilisierten Adenoviren festgehalten.
Gleichzeitig können rekombinante Gene
durch die immobilisierten Adenoviren in die
Zellen übertragen werden.
Ausblick
Mit der im Projektverlauf erstellten Bibliothek
von validierten, adenoviralen Vektoren, die
die Expression aller humanen Kinasen durch
siRNA-vermittelte Inhibition dauerhaft
unterdrücken können, ist auch eine Analyse
von schwer transfizierbaren Zellen, wie zum
Beispiel primären Zellen, möglich. Das Arrayformat
gewährleistet dabei die parallele und
miniaturisierte Übertragung von Genen im
erhöhten Durchsatz. Bisher fehlte ein Ansatz,
der eine parallele funktionelle Analyse aller
menschlichen Proteinkinasen in lebenden
Zellen und gleichzeitig eine Miniaturisierung
durch den Einsatz der Chip-Technologie
ermöglicht.
Korrespondenzadresse
Dr. Achim Knappik
Antibodies by Design –
a Division of MorphoSys
Tel: +49-(0)89-89927-234
Fax: +49-(0)89-89927-5234
eMail: knappik@A-by-D.com, www.A-by-D.com
T E C H - T R A N S F E R
RNA-Interferenz
�
Neuartiges siRNA-Design
verbessert RNA-Interferenz
Die RNA-Interferenz (RNAi) –. die Technik
mittels kurzer doppelsträngiger RNA-
Moleküle (siRNAs) über RNA-induzierte
Effektorkomplexe (RISC) gezielt Gene
auszuschalten – hat seit ihrer Entdeckung
vor wenigen Jahren die Molekularbiologie
Abb: Nur unstrukturierte antisense-siRNAs
(links) können effizient RNA-Interferenz
(RNAi) induzieren. Auf der Basis einer neuen
Software können hochaktive unstrukturierte
antisense-siRNAs gezielt identifiziert und designt
werden.
revolutioniert. SiRNAs sind heute einerseits
wichtige Werkzeuge bei der funktionalen
Validierung unbekannter Genfunktionen,
andererseits rücken sie zunehmend in den
Fokus einer RNA-basierten Wirkstoffentwicklung.
Statistisch weist allerdings nur ein
kleiner Teil aller siRNAs, die sich gegen ein
bestimmtes Ziel(Target)-Gen richten lassen,
eine befriedigende Aktivität auf, und ein
treffsicheres Design aktiver Moleküle stellt
nach wie vor eine Herausforderung dar.
Gezielte Auswahl aktiver siRNAs
Bisher basierte die Auswahl aktiver siRNA
Duplexe, welche aus einer ‚antisense-siRNA’
(as-siRNAs) und einer ‚sense-siRNA’ bestehen,
im wesentlichen auf der Berücksichtigung
thermodynamischer Duplexparameter,
bestimmter Basenabfolgen und Basengehalte
sowie gegebenenfalls auf der Analyse von
Strukturen der Target-mRNAs. Die Arbeits-
Dr. Volker Patzel, Max-Planck-Institut für Infektionsbiologie, Berlin
gruppe von Dr. Volker Patzel in der von Prof.
Dr. Stefan Kaufmann geleiteten Abteilung
für Immunologie des Berliner Max-Planck-
Instituts für Infektionsbiologie konnte
kürzlich zeigen, daß die bisher vernachlässigten
Sekundärstrukturen der as-siRNAs die
RNAi-Effizienz entscheidend beeinflussen.
Je weniger Struktur die as-siRNA aufweist,
desto besser kann diese vermutlich RISC an
die mRNA heranführen, und desto aktiver ist
die siRNA. Am vielversprechendsten sind dabei
völlig unstrukturierte as-siRNAs. Durch
gezielte Basenaustausche werden diese
hochaktiven, aber seltenen unstrukturierten
as-siRNAs außerdem in ausreichendem Maße
zugänglich gemacht.
Neues Tool
Eine systematische Computeranalyse deutet
ferner darauf hin, daß auch bei den mikroRNAs
(miRNAs) die Strukturen der den
as-siRNAs entsprechenden reifen miRNAs,
eine wichtige Rolle spielen. MiRNAs repräsentieren
natürliche zelluläre Analoga zu den
siRNAs, und es wird heute davon ausgegangen,
daß ein großer Teil der menschlichen
Genexpression durch miRNAs gesteuert
wird. Damit kommt dieser Arbeit neben der
anwendungsbezogenen auch eine grundlagenwissenschaftliche
Bedeutung zu.
Die Ergebnisse dieser Arbeit, die in Kooperation
mit dem Deutschen Rheuma-Forschungszentrum
erfolgte, wurden kürzlich
in der Zeitschrift NATURE BIOTECHNOLOGY (online:
30. Oktober 2005, doi: 10.1038/nbt1151)
veröffentlicht. Das neuartige siRNA-Design
wurde in eine Software implementiert und
ist über das Steinbeis Transferzentrum
Nucleic Acids Design (www.stz-nad.com)
erhältlich.
Korrespondenzadresse
Dr. Volker Patzel, MBA
Arbeitsgruppenleiter
Abteilung für Immunologie
Campus Charité Mitte
Max-Planck-Institut für Infektionsbiologie
Schumannstraße 21/22
D-10117 Berlin
eMail: patzel@mpiib-berlin.mpg.de
www.mpiib-berlin.mpg.de
LABORWELT 6. Jahrgang | Nr. 6/2005 | 41