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DNA-Microarrays � R E P O R T Genexpressionsanalysen bei Leukämien: Diagnostik der Zukunft? Prof. Dr. Dr. Torsten Haferlach, PD Dr. Susanne Schnittger, PD Dr. Wolfgang Kern, PD Dr. Claudia Schoch, MLL Münchner Leukämielabor GmbH Eine umfassende Leukämiediagnose beruht auf einer individuellen Kombination verschiedender Methoden. So kommen parallel eine Kombination von Zytomorphologie, Zytochemie, Zytogenetik, Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung, Durchflußzytometrie und PCR-basierten molekulargenetischen Methoden zum Einsatz. Seit kurzem ermöglicht nun die Technik der Genexpressionsanalyse mit Microarrays eine simultane Expressionsmessung von Zehntausenden Genen. Die spezifische Signatur erlaubt anschließend das Erstellen eines molekularen Fingerabdrucks. Es ist zu erwarten, daß die Anwendung von Microarrays zu einer verbesserten molekularen Diagnostik, zu Fortschritten im pathogenetischen Verständnis von malignen und benignen Erkrankungen sowie zur Entwicklung neuer Therapieoptionen führen wird. Es ist darüber hinaus sehr wahrscheinlich, daß mit den Ergebnissen aus Microarray-Experimenten neue, krankheitsspezifische Zielmoleküle für maßgeschneiderte Medikamente sowie individuelle Gene zum Nachweis minimaler Resterkrankung identifiziert werden. Neuere Studien weisen auch darauf hin, daß sich Expressionsprofile mit prognostischen Parametern korrelieren lassen. Auf der Basis von Genexpressionsprofilen könnte die Leukämiediagnostik in absehbarer Zeit auf einer einzigen Plattform schnell, robust und – bei entsprechender Anwendung – auch kostengünstiger als bisher erfolgen. Key Words: Leukämie, Diagnostik, molekulare Marker, Genexpressionsanalyse, Microarrays Abb. 1: Schematische Darstellung der Microarray-Technologie. Bei den DNA-Oligonukleotid- Microarrays (linke Seite) wird pro Experiment eine Probe hybridisiert. Die Detektion erfolgt durch einen Fluoreszenzfarbstoff und ergibt für jedes Gen einen absoluten Expressionswert. Bei den gespotteten Microarrays (rechte Seite) wird die Test-RNA mit einer Kontroll-RNA co-hybridisiert. Beide RNA-Spezies werden mit unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen markiert. Nach Detektion des Fluoreszenzsignals ergibt sich ein Verhältnis aus Test- und Kontroll-RNA. Im Schema ist die Test-RNA überrepräsentiert, was einem überexprimierten Gen entspräche. Kennziffer 13 LW 06 · www.biocom.de � Die Leukämiediagnostik und -klassifikation beruhte bisher zum Teil auf relativ subjektiven Kriterien: Bei der klassischen Methode der Diagnostik – die Zytomorphologie und die Histologie – müssen sogenannte Blasten quantifiziert werden. Zur genaueren Klassifikation dann ergänzend die Zytochemie zu Rate gezogen. Daneben kommen die Multiparameter-Immunphänotypisierung,Zytogenetik, Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung und die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) zur Anwendung. Häufig führt nur eine Kombination der genannten Methoden zur Diagnose der jeweiligen Sub-Entität und zur Wahl der spezifischen Therapie 1 . Mit der Microarray- Technologie hat sich in den vergangenen fünf Jahren zunächst in der Forschung eine neue Methode etabliert, die eine Verbesserung der Klassifikation von Leukämien zu ermöglichen scheint und damit in absehbarer Zeit auch für die Routine-Diagnostik eingesetzt werden könnte. Microarray-Plattformen Zwei verschiedene Methoden können unterschieden werden: DNA-Oligonukleotid-Microarrays und cDNA-gespottete Arrays (Abb. 1). Auf den DNA-Oligonukleotid-Microarrays werden genspezifische Sequenzen an definierten Positionen auf dem Microarray insitu synthetisiert. Die zu untersuchende Probe (ca. 5 µg Gesamt-RNA; entspricht ca. 1-8 x 10 6 Zellen) wird in cDNA umgeschrieben und in einer nachfolgenden in-vitro-Transkription amplifiziert. Dabei werden von der T7-RNA- Polymerase biotinylierte Ribonukleotide in die wachsenden cRNA-Stränge inkorporiert. 10 µg fragmentierte und Biotin-markierte cRNA werden pro Experiment auf dem Microarray hybridisiert. Die Detektion erfolgt nach Anfärben der DNA-cRNA-Hybride mit Streptavidin-Phycoerythrin mittels eines Argon-Ionen-Lasers. So finden sich beispielsweise auf dem aktuellen HG-U133 2.0 plus Microarray der US-Firma Affymetrix rund 40.000 humane Gene durch jeweils 11 verschiedene Oligonukleotide repräsentiert. Als interne mismatch-Kontrolle werden ebenfalls sequenzspezifische Oligonukleotide mit einer zentralen Punktmutation verwendet. Die Ergebnisse sind sehr gut reproduzierbar. Bei der Auswahl der Proben muß auf eine möglichst homogene Zellzusammensetzung geachtet werden. Leukämieproben haben aber meist einen Anteil von mehr als 70% malignen Zellen – speziell nach Ficoll-Gradient – und bieten deshalb für Genexpressionsanalysen eine gute Grundlage. Eine umfassende, biomathematisch gestützte Analyse der Ergebnisse, die auf verschiedene Algorithmen zurückgreifen muß, kann heute nur zum Teil durch bereits mit- 6 | 6. Jahrgang | Nr. 6/2005 LABORWELT
CHROMATOGRAPHY Unique Media Created from a distinct ceramic support, Bio-Rad’s CHT ceramic hydroxyapatite and new CFT ceramic fluoroapatite media offer unsurpassed results. � New CFT ceramic fluoroapatite expands your choice of purification at pH values as low as 5.0 � High density of particles speeds and simplifies column packing procedures � Sintering at temperatures from 400 to 700°C guarantees a heavy-duty, durable support � Rigid particles provide fast cleaning and equilibration � Inorganic calcium phosphate backbone provides distinctive selectivities not seen in agarose and other organic materials For more information on CHT and CFT media, visit us on the Web at www.bio-rad.com/ad/cft/ Visit us on the Web at discover.bio-rad.com For more information call +49 (89) 31884-177 A280 A280 0.2 0.1 0.0 2.0 1.0 0.0 0 lgG 1 Protein A 25 50 Run time, min Separation of Protein A and lgG on CHT Type I 0 450 cm/hr 300 cm/hr 150 cm/hr 30 60 Run time, min 90 Effect of Flow Rate on lgG Capture on CFT Type II
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