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Proteomics
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W I S S E N S C H A F T
Präparative Aufreinigung von
Organellen mit Immuno-FFE
Markus Islinger 1 , Heribert Mohr 1 , Alfred Völkl 1 , Anatomie und Zellbiologie,
Universität Heidelberg; Gerhard Weber, Christoph Eckerskorn; BD Diagnostics, Martinsried
Als trägerfreie Separationstechnik unter kontinuierlichem Durchfluß bietet die Free-Flow-
Elektrophorese (FFE) ein breites Applikationsspektrum bei der Trennung von biologischem
Probenmaterial wie Peptiden, Proteinen, Proteinkomplexen bis zu vollständigen, intakten
Zellorganellen. Hierbei spielt vor allem die hohe Modularität des Systems hinsichtlich der
verwendeten Trennprinzipien eine ausschlaggebende Rolle: So bieten sich Zonenelektrophorese,
isoelektrische Fokussierung oder Isotachophorese als separierendes Prinzip an. Darüber
hinaus besteht jedoch die Möglichkeit, die hohe Affinität von Antigen-Antikörper-Reaktionen
für die Isolierung von Einzelsubstanzen aus komplexen biologischen Gemischen zu nutzen.
Diesbezüglich stellt die Technik der Immuno-Free-Flow-Elektrophorese eine effektive Methode
dar, intakte Organellen aus Zellhomogenaten zu isolieren, die – wenn überhaupt – sonst nur
durch aufwendige Zentrifugationsverfahren anzureichern sind.
Die überraschend niedrige Anzahl von Genen
in den Genomen höherer Organismen legt ein
komplexes Regulationswerk auf der Ebene
der Proteinexpression innerhalb einer Zelle
nahe, das eine Gesamtanzahl von mehreren
hunderttausend Proteinspezies erwarten
läßt. In dieser Hinsicht steht die Proteomforschung
vor der Aufgabe, nicht nur die
Gesamtheit der in einem Organismus auftretenden
Genprodukte zu erfassen, sondern
auch zwischen funktionell unterschiedlichen
Spleißvarianten und posttranlationalen Modifikationen,
wie Phosphorylierungen und
Glycosylierungen zu unterscheiden. Die zunehmende
Automatisierung der massenspektrometrischen
Proteinanalytik erlaubt es zwar
mittlerweile, Proteine in hohem Durchsatz zu
identifizieren und zu quantifizieren, jedoch
erfordert der hohe dynamische Bereich in der
Abundanz unterschiedlicher Proteine meist
eine vorangehende Probenfraktionierung,
um auch gering vertretene, aber potentiell
physiologisch bedeutende Proteine zu erfassen.
Diesbezüglich bietet die Isolierung
von Organellen die Möglichkeit, Zellen nicht
nur effektiv zu fraktionieren, sondern auch
identifizierte Proteine einer für das Organell
spezifischen Aufgabe zuzuordnen und so
erste Hinweise auf die Funktion bisher noch
unbekannter Proteine zu gewinnen.
Meist werden Organellen auf klassische
Weise über mehrere differentielle Zentrifugationsschritte
und/oder Dichtegradientenzentrifugation
gewonnen. Jedoch führen
diese Verfahren häufig zu Materialverlusten
und -veränderungen aufgrund der hohen
mechanischen Belastungen während des
Trennprozesses. Darüber hinaus erlauben sie
keine befriedigende Isolierung von Organellpopulationen
mit ähnlicher Dichte. Als kon-
Abb. 1: BD Free Flow
Electrophoresis-
System
Abb. 2: a) Abtrennung eines peroxisomalen
Peaks von der Hauptmasse der Organellen.
Die IFFE wurde mit einer D-Fraktion der Rattenleber
nach vorheriger Inkubation mit peroxisomalem
Membranantikörper (anti-PMP70)
durchgeführt. b) Negativkontrolle einer Zonen-
FFE ohne vorherige Antikörperinkubation, Es
treten zwar Anreicherungen auf, jedoch keine
deutlich voneinander getrennten Einzelpeaks.
Die Farben verdeutlichen Fraktionen mit überwiegender
Anreicherung folgender Organellen
im Trennprofil: gelb – Mikrosomen, grün –
Mitochondrien, rot – Peroxisomen.
tinuierliches, rein auf flüssigen Trennphasen
basierendes Verfahren stellt die Free-Flow-
Elektrophorese (FFE) in beiderlei Hinsicht
eine Alternative zu herkömmlichen Trennmethoden
dar. Sie arbeitet nach dem Prinzip
einer trägerfreien Elektrophorese, bei der
der Trennprozeß in Abwesenheit einer festen
Matrix stattfindet, wie beispielsweise Acrylamid
in der Gelelektrophorese. Statt dessen
werden Analyte in einem kontinuierlichen
laminaren Fluß von Pufferlösungen durch ein
dazu senkrecht angelegtes elektrisches Feld
entsprechend ihrer Ladung und Mobilität
aufgetrennt (Abb. 1). In den vergangenen
Jahren konnten in der Tat unterschiedliche
Zellorganellen wie Mitochondrien 1 , Melanosomen
2 , sekretorische Vesikel 3 oder Endosomen
4 über klassische Zonenelektrophorese
gereinigt werden. Aufgrund der teilweise
hohen Ladungsheterogenität von Zellorganellen
und ihrer Ähnlichkeit in anderen
physikalischen Eigenschaften bleiben solche
Fraktionen abhängig vom Ausgangsgewebe
jedoch häufig weiterhin mit anderen Organellpopulationen
verunreinigt. Antigen-An-
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24 | 6. Jahrgang | Nr. 6/2005 LABORWELT