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Wegen der Bedeutung des Nachweises von
Lebensmittelallergenen wird im Rahmen
eines Kooperationsprojektes (AllergenChip)
ein System auf der Basis eines DNA-Chips
zum parallelen Nachweis der wichtigsten
Lebensmittelallergene entwickelt.
Entwicklung eines
Biochip-Testsystems
Im Zuge der Assayoptimierung liegt ein entscheidender
Fokus auf dem Einsparen von
Zeit und Kosten. Eine Möglichkeit hierfür
bietet die Möglichkeit der Multiplexanalyse,
also der parallele Nachweis verschiedener
Parameter in einem einzigen Versuchsansatz.
Die PCR-Verfahren bieten die Voraussetzung,
auch aus unterschiedlichsten
Lebensmittel- oder Rohstoffproben sensitiv
geringe Mengen oder Kontaminationen an
Lebensmittelallergenen zu detektieren. Die
Detektion erfolgt über die in der Lebensmittelanalytik
immer mehr an Bedeutung
gewinnende Real-time-PCR mit spezifischen
Hybridisierungssonden. Ein Einzelnachweis
von Sellerie mittels Real-time-PCR ist in
Abbildung 2 (S. 31) gezeigt.
Nachteil dieses Verfahrens ist, daß ein
Multiplexing nur begrenzt möglich ist. Für
die Differenzierung der mit Allergenen
assoziierten DNA-Sequenzen müßten diese
jeweils mit verschiedenen Fluoreszenzfarbstoffen
markiert werden. Hier kommt es zu
der Schwierigkeit, daß die herkömmlichen
Real-time-Cycler durch die Anzahl der
verfügbaren Detektionskanäle meist zu ein-
B L I T Z L I C H T
geschränkt sind, um mehrere verschiedene
Analyte parallel zu detektieren.
Eine Möglichkeit, dies zu umgehen,
bieten Microarrays. Durch ortsaufgelöste
Plazierung in Nanometer- bis Mikrometer-
Abständen können bis zu mehrere tausend
DNA-Sonden in einem definierten Raster
für die parallele Analyse genutzt werden.
Aufgrund dieser Tatsache kann bereits
mit nur einem Fluoreszenzfarbstoff eine
Multiplexdetektion erfolgen. Wegen der
Miniaturisierung, die mit dem Einsatz eines
Microarrays erzielt wird, sind nur geringe
Abb. 3: Nachweis vier verschiedener Lebensmittelallergene mit Hilfe des AllergenChips. Oben
dargestellt ist der parallele Nachweis von Soja (6), Walnuß (7), Sellerie (8) und Sesam (10) aus
einem DNA-Gemisch. Im Modell wurden die vier verschiedenen Lebensmittelallergensequenzen
in der PCR amplifiziert und anschließend über Hybridisierung auf dem AllergenChip nachgewiesen.
Das Chiplayout liegt in vierfacher Ausführung vor. Legende: 1. Negativkontrollen, 2. Hybridisierungskontrolle,
3. Haselnuß, 4. Erdnuß, 5. Mandel, 6. Soja, 7. Walnuß, 8. Sellerie, 9. Senf,
10. Sesam, 11. Gluten, 12. Fisch.
Probenvolumina nötig, um eine Detektion
durchzuführen.
Als mögliche künftige Anwendungsmöglichkeit
wurden die Entwicklung und der
Einsatz eines diagnostischen Low-density-
Microarrays innerhalb des AllergenChip-
Projektes definiert. Der AllergenChip soll in
der Lage sein, alle relevanten Lebensmittelallergene,
die sogenannten „Big 8“, mit Hilfe
spezifischer DNA-Sonden zu detektieren.
Methodik
Der methodische Ablauf für die Analyse potentiell
kontaminierter Lebensmittel umfaßt
im wesentlichen drei Schritte: Probenaufarbeitung,
PCR und Detektion auf dem Chip.
Zu Beginn der Analyse wird aus der zu
analysierenden Lebensmittelprobe die DNA
isoliert und für die PCR aufgearbeitet. Für
die Aufarbeitung der Lebensmittelproben
hat die Firma Congen spezielle DNA-Isolationskits
(SureFood PREP Allergen) entwickelt,
mit denen qualitativ hochwertige DNA aus
verschiedenen Lebensmittelmatrizes für die
weitere Anwendung extrahiert werden kann.
Die extrahierte Gesamt-DNA wird in einer
PCR eingesetzt. Für die Chip-PCR werden
die gleichen Primersysteme verwendet, die
auch in der Real-time-Diagnostik Anwendung
finden und dort bereits validiert wurden.
Während der PCR werden vorhandene
Kontaminationen mit DNA aus Lebensmittelallergenen
sensitiv detektiert und über
einen entsprechend modifizierten Primer
mit dem Fluoreszenzfarbstoff Cy5 markiert.
Die Fluoreszenzmarkierung ermöglicht die
spätere Detektion auf dem Microarray. Eine
weitere Zeit- und Kostenersparnis kann mit
Multiplex-PCR-Verfahren erzielt werden.
Diese werden derzeit getestet.
Ein wichtiger Faktor ist die Sensitivität
des Gesamtassays. Diese wurde dahingehend
optimiert, daß für alle Allergene eine
Nachweisgrenze im unteren ppm-Bereich
(< 10 ppm) erreicht wird.
Über die Hybridisierung an immobilisierten
Sonden erfolgt die Detektion auf dem Allergen-
Chip. Liegt eine Kontamination mit der DNA
eines der gesuchten Lebensmittelallergene vor,
so kann das zuvor in der PCR amplifizierte
DNA-Produkt an die komplementäre Sonde
auf dem Chip hybridisieren und über die Fluoreszenzmarkierung
ortsaufgelöst detektiert
werden. Die Auswertung und Quantifizierung
erfolgt mit Hilfe eines Microarray-Scanners
wie etwa dem im FhG-IBMT entwickelten
Low-cost-Scanner „Freader“.
In Modellversuchen konnten wir bereits
verschiedene Lebensmittelallergene erfolgreich
mit Hilfe des AllergenChips parallel
nachweisen (Abb. 3). Eine Erweiterung auf
weitere relevante Lebensmittelallergene ist
derzeit in der Testphase.
Literatur
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Korrespondenzadresse
Dr. Eva Ehrentreich-Förster
FhG IMBT
Arthur-Scheunert-Allee 114-116
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36 | 6. Jahrgang | Nr. 6/2005 LABORWELT