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N E T Z W E R K
Abb. 2: A. Das FLEX-System bietet die Möglichkeit zur konditionalen Mutagenese. Zwei mutagene
Kassetten werden von einer Kombination von mutierten und Wildtyp-Rekombinase-Erkennungs-Sites
flankiert. Die FLPe-Rekombinase wird jeweils nur zwischen den homologen Erkennungsstellen
rekombinieren (hier: grün und grün oder gelb und gelb). Weil aber die Orientierung
der Sites gegenläufig ist, wird die Rekombinase die Kassette jeweils nur zwischen grün oder
gelb umdrehen. Dies sind jeweils transiente, reversible Zustände (hier gezeigt für Rekombination
zwischen den gelben Sites). Dabei kommt jedoch immer eine gelbe bzw. eine grüne Site auf
die andere Seite der Kassette und ist nunmehr mit der jeweils anderen kompatiblen Site gleich
orientiert. In diesem Fall wird die Rekombinase zwischen diesen beiden Stellen rekombinieren
und dabei die nicht-kompatible Site dazwischen ausschneiden (step 1). Das Ergebnis ist in jedem
Fall das gleiche: die mutagene Kassette ist irreversibel in eine nicht-mutagene Richtung gedreht
und nunmehr von zwei inkompatiblen FLPe-Stellen flankiert. Nutzt man zwei unterschiedliche
Rekombinasen (hier Cre-Rekombinase und rote bzw. pinkfarbene loxP-Sites), so kann man auf
diese Weise Kassetten lediglich in bestimmten Geweben oder aber zu unterschiedlichen Zeitpunkten
der Entwicklung mutagen wirken lassen beziehungsweise frühe Letalität umgehen.
B: Beim Targeted Trapping werden promotorlose konditionale Genfallenvektoren mit Hilfe der
homologen Rekombination in das erste Intron von Genen gebracht, welche in ES-Zellen zwar exprimiert,
aber aus unterschiedlichen Gründen bislang nicht getrappt wurden. Dort funktionieren
sie genau wie konventionelle Genfallenkassetten. Diese promotorlosen Konstrukte haben eine
ungewöhnlich hohe Rekombinationsrate.
C: Beim Gene Targeting werden Selektionskassetten mit eigenen Promotoren benutzt, welche
nach der Drehung durch FLPe eliminiert werden können, weil sie zwischen zwei frt-sites lokalisiert
sind. Auch dieser Ansatz wird eine Insertions-Mutagenese sein. Durch Einbringen einer
zweiten loxP-site in den Lokus können jedoch auch Cre-vermittelte Deletionen induziert werden.
Vergangenheit insbesondere von den Mitgliedern
des International Gene Trap Consortium
(IGTC; www.igtc.org; Abb. 3) demonstriert.
Zusammengenommen wurden beim IGTC
mehr als 2.000 mutierte Maus-ES-Zellen von
der Wissenschaftsgemeinschaft angefordert,
um an allen Orten der Welt Mausmutanten zu
produzieren. Die Mitglieder des IGTC haben
sich auch bei der Akquisition von Fördermitteln
gegenseitig inspiriert. Die europäischen
Partner des IGTC, namentlich das German
Gene Trap Consortium (Wolfgang Wurst)
und das Sanger Institute (Allan Bradley),
sind maßgeblich an der Realisation und Koordination
von EUCOMM beteiligt, während
die nordamerikanischen Partner in Manitoba
(Geoff Hicks) und Toronto (Janet Rossant)
ein komplementäres Verbundprojekt (Nor-
COMM) auf der anderen Seite des Atlantik
anführen werden.
Das EUCOMM-Konsortium ist ein Zusammenschluß
von 11 hochrangigen Institutionen
aus vier europäischen Ländern.
Die EUCOMM-Partner werden konditionale
Mutationen in insgesamt bis zu 20.000 Mausgenen
mithilfe von ‚gene trapping‘, ‚targeted
trapping‘ und ‚gene targeting‘-Ansätzen
generieren (siehe Abb. 2a-2c). Zudem werden
bis zu 300 konditionale Mausmutanten
etabliert und archiviert werden.
Insbesondere zwei neue Technologien, die
FLEX-Technologie (Schnütgen et al, 2005; s.
Abb. 2a) und die ‚targeted trapping‘-Technologie
(Friedel et al., 2005; s. Abb. 2b), werden
innerhalb des EUCOMM-Projektes in großem
Maßstab eingesetzt werden. Die targeted
trapping-Technologie ist, kurz gesagt, gene
trapping mit Hilfe der homologen Rekombination.
Dabei können von Splice-Akzeptor-
Genfallenvektoren auch diejenigen Gene
angesteuert werden, die zwar in embryonalen
Stammzellen exprimiert werden, aber bislang
nicht durch gene trapping mutiert werden
konnten – entweder weil sie zu klein sind
oder weil ihr Expressionsniveau zu niedrig
ist. Da dieser targeted trapping-Ansatz aber
nur für in ES-Zellen exprimierte Gene effizient
eingesetzt werden kann, müssen die nicht
exprimierten Gene durch gene targeting mu-
Abb. 3: Das Internationale Gene Trap Consortium
(IGTC; www.igtc.org) ist ein Zusammenschluß
der weltweit größten Gene
Trapping-Zentren, wobei das German Gene
Trap Consortium (GGTC; www.genetrap.de)
hinsichtlich der Anzahl der eingebrachten
Klone der größte Partner ist. Weitere Partner
sind das Sanger Institute, Großbritannien;
BayGenomics, USA; Fred Hutchinson, USA; Yamamoto,
Japan; Mount Sinai, Toronto; ESCDB,
Manitoba; TIGEM, Italien.
32 | 6. Jahrgang | Nr. 6/2005 LABORWELT