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W I S S E N S C H A F T
Abb. 3: a. SDS-PAGE von Peroxisomen nach Isolierung über Immuno-FFE (2) oder Dichtegradientenzentrifugation
(3) im Vergleich zur Ausgangsfraktion (1). b. Immunoblotanalyse der durch
Immuno-FFE isolierten Peroxisomen. Zum Nachweis der Peroxisomen wurden polyklonale
Antikörper gegen Acyl-CoA-Oxidase (AOx), Uratoxidase (UOx) und PMP22 verwendet. Mitochondrien
wurden mir einem Antiserum gegen ein nicht weiter charakterisiertes mitochondriales
Membranprotein detektiert. Ausgangsfraktion (D-Fraktion, A), Vereinigte Fraktionen 22-25 der
IFFE (B), vereinigte Fraktionen 31-35 der IFFE (C). c- Immunelektronenmikroskopie der IFFE-isolierten
Peroxisomen mit Katalaseantikörper. Die einzelnen Organellen sind von einer durchgehenden
Membran umgeben und weisen in ihrer Matrix hohe Konzentrationen von Katalase auf.
tikörperinteraktionen bieten die Möglichkeit,
Proteine mit hoher Affinität zu binden und
somit Einzelproteine hochspezifisch aus Proteingemischen
über Affinitäts-Chromatographie
zu isolieren. Während sich die herkömmliche
Affinität-Chromatographie aufgrund der
hohen auftretenden Scherkräfte nicht zur
Aufreinigung intakter Organellen eignet,
stellt die Immuno-Free-Flow-Elektrophorese
(IFFE) diesbezüglich durch die in flüssiger
Phase stattfindende Trennung ein schonendes
und effektives Alternativverfahren für die
Isolierung von Organellen dar. Aufgrund ihres
nahezu identischen pIs sind Antikörper im
elektrischen Feld bei einem pH 8,0 weitgehend
unbeweglich, da sie nahezu keine Nettoladung
besitzen, und lassen sich daher als scharf geschnittener
homogener Peak nahe der Anode
der FFE-Trennkammer fokussieren. Folglich
bewirkt der Antikörper-pI nach Kopplung
an spezifische Oberflächenmoleküle eines
Organells eine drastische Veränderung des
Masse/Ladungsverhältnisses und somit eine
deutlich verminderte Mobilität im elektrischen
Feld der FFE. Dies führt zu einer Ablenkung
der Antikörper-gekoppelten Organellen aus
der Hauptmasse des Partikelstroms.
Applikation
Zur Etablierung und Validierung dieses
Verfahrens wurden Rattenleber-Peroxisomen
aus einem grob vorgereinigten Leberhomogenat
(D-Fraktion 5 ) aufgereinigt und
mit der Reinheit von herkömmlich durch
Dichtgradientenzentrifugation isolierten
Peroxisomen verglichen 6 . Zur Kopplung an
die Peroxisomen wurden D-Fraktion und ein
polyklonaler PMP70-Antikörper (peroxisomal
membrane protein of 70 kDa) für eine Stunde
bei Raumtemperatur inkubiert. Durch Zentrifugation
wurden die Organellen anschließend
von überschüssigem Antikörper getrennt
und in Puffer für die IFFE resuspendiert. Zur
Auftrennung wurde die Organellsuspension
fortlaufend in die Trennkammer eingebracht,
unter zonenelektrophoretischen Bedingungen
getrennt und kontinuierlich in 96 Fraktionen
auf Mikrotiterplatten gesammelt. Wie in
Abbildung 2a anhand des Absorptionsspektrums
bei 280 nm dargestellt, wandern die
mit Antikörper beladenen Peroxisomen durch
die verringerte Ladungsdichte im elektrischen
Feld deutlich verlangsamt und werden dadurch
als Seitenpeak deutlich vom Hauptpeak
der Mitochondrien abgetrennt. Ein Vergleich
mit einer ohne vorherige Antikörperbeladung
durchgeführten FFE (Abb. 2b) verdeutlicht
das Potential der Methode. Um die Reinheit
der mittels IFFE isolierten Peroxisomen zu
beurteilen, wurden das bei der SDS-PAGE
erhaltene Proteinmuster mit dem von Peroxisomen
verglichen, die mit herkömmlicher
Dichtegradientenzentrifugation isoliert wurden.
Wie in Abbildung 3a gezeigt, stimmen
beide Bandenmuster fast vollständig überein,
unterscheiden sich aber signifikant von der für
beide Separationstechniken verwendeten Ausgangsfraktionen.
Auch im Immunoblot (Abb.
3b) verdeutlichen die peroxisomalen Markerproteine
Acyl-CoA-Oxidase, Uratoxidase und
PMP22 die fast quantitative Aufreinigung der
Peroxisomen im Seitenpeak des Trennprofils.
Dagegen überwiegen in der Ausgangsprobe
(D-Pellet) Mitochondrien (MMP), die überwiegend
im Hauptpeak des Trennprofils angereichert
werden. Die Intaktheit der isolierten
Organellen demonstrieren die in Abbildung
3c dargestellten elektronenmikroskopischen
Schnitte. Die über IFFE isolierten Peroxisomen
sind von einer kontinuierlichen, gut erhaltenen
Membran umgeben. Die Immunmarkierung
mit Goldpartikeln gegen das peroxisomale
Matrixenzym Katalase zeigt eine intensive
Markierung des Organellinneren, während
nur wenige Partikel außerhalb zu finden sind,
so daß von nur geringen Verlusten während
der Homogenisation und Isolierung der Organellen
auszugehen ist.
Wie in dieser Arbeit gezeigt, eignet sich
die Methode der Immuno-Free-Flow-Elektrophorese
zur Gewinnung hochreiner Organellfraktionen
von hoher Qualität, die folglich
direkt zur nachfolgenden Proteomanalyse
verwendet werden können. Die Beschränkung
der Methode ist natürlich durch die
Verfügbarkeit relativ großer Antikörpermengen
vorgegeben, die die Verwendung von in
großen Mengen, mit gleichbleibender Qualität
produzierbarer monoklonaler Antikörper
voraussetzen.
Die eindeutige Stärke der Methode liegt
jedoch in ihrem Potential, auch physikalisch
sehr ähnliche Zellkompartimente voneinander
trennen zu können 7,8 . Bei Verfügbarkeit
geeigneter Antikörper verspricht die IFFE
besonders im Bereich äußerst heterogener
Organellpopulationen, wie etwa synaptischer
Vesikel oder Mikrosomen, eine Auftrennung
in analysierbare, klar voneinander abzugrenzende
Subfraktionen, die einen wertvollen
Beitrag zum Verständnis biologisch komplexer
Zellstrukturen leisten kann.
Literatur
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[8] Mohr, H., A. Völkl (2002) “Isolation of peroxisomal subpopulations from
mouse liver by immune free-flow electrophoresis.” Electrophoresis 23:
2130-7.
Korrespondenzadressen
Dr. Markus Islinger
Institut für Anatomie und Zellbiologie II
Universität Heidelberg
Im Neuenheimer Feld 307
D-69120 Heidelberg
Markus.Islinger@urz.uni-heidelberg.de
PD Dr. Christoph Eckerskorn
BD Diagnostics, Preanalytical Systems
Im Innovationszentrum Biotechnologie
D-82152 Martinsried
Christoph_Eckerskorn@europe.bd.com
26 | 6. Jahrgang | Nr. 6/2005 LABORWELT