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16 Forschung
Abb.2 Analyse der Überlebenszeit von Nacktmäusen, denen Neuroblastomzellen
transplantiert wurden, die mit dem p75 Rezeptor (w/ p75) oder einem leeren Kontrollvektor
(w/o p75) transfiziert wurden. Während sich in den Mäusen, denen p75- transfizierte
Zellen verabreicht wurden, keine Tumoren bilden, entwickeln sich in Kontrolltieren
Tumoren (y-Achse= Überlebenswahrscheinlichkeit, 1.0 entspricht 100%.
dem Differenzierungsgrad der Neuroblastome und seiner gutartigen
Varianten korreliert. Darüber hinaus kommt auch der
Expressionshöhe eine prognostische Bedeutung zu. Eine Aussage
zur funktionellen Bedeutung kann aber anhand der Expressionsdaten
alleine nicht getroffen werden.
Welche Auswirkungen hat die Expression
von p75 auf Neuroblastomzellen?
Um zu untersuchen, ob die Expression des p75 Rezeptors lediglich
ein Indikator der Differenzierung ist, oder dem p75 Rezeptor
eine funktionelle Bedeutung zukommt, exprimierten wir den
p75 Rezeptor ektop (d.h. normalerweise in diesen Zellen nicht
vorkommend) in Neuroblastomzellen. Dazu transfizierten wir die
p75-negative humane Neuroblastomzelllinie SY5Y stabil mit
einem Retrovirus, der für den p75 Rezeptor kodiert. Nach stabiler
Transfektion und Etablierung von Einzelzellklonen untersuchten
wir zunächst den Einfluss der ektopen p75 Expression auf die
Lebensfähigkeit der Zellen. Dazu führten wir zunächst einen so
genannten MTT-Test durch. MTT ist ein Farbstoff, der durch
lebende Zellen umgesetzt wird. Wir beobachteten eine eindeutige
Abnahme der Lebensfähigkeit der Zellen bei den p75-positiven
Zellen im Vergleich zu den mit einem Leervektor transfizierten
Kontrollzellen. Die Zugabe von NGF zum Nährmedium hatte
auf die Lebensfähigkeit der Zellen keinen Einfluss. Grundlage der
verminderten Zell-Lebensfähigkeit kann eine reduzierte Zellteilung
oder eine erhöhte Zelltodrate sein. Um zwischen diesen
Effekten zu unterscheiden, führten wir einen BrdU (BrdU wird zur
labordiagnostischen Markierung sich teilender Zellen in Geweben
verwendet) Zellteilungstest durch, durch den der Einbau
von BrdU bei der DNA-Neusynthese gemessen wird, sowie einen
Annexin V Test, durch den direkt die Zahl der apoptotischen Zellen
in der Durchflusszytometrie gemessen wurde. Es zeigte sich,
dass nach äußerer p75 Expression sowohl eine verringerte Zellteilung
als auch eine signifikante Erhöhung der Zelltodrate zu
beobachten waren.
Die Expression des p75 Rezeptors beeinflusst also mit Zelltod-
und Zellteilungsrate gleich zwei entscheidende Aspekte der
Biologie von Tumorzellen.
Hat die p75-Expression Einfluss
auf die Tumorigenität in vivo?
Um die funktionelle Bedeutung für das Wachstum der Neuroblastomzellen
im Gesamtorganismus in vivo zu untersuchten, führten
wir Untersuchungen der Tumorigenität (die Fähigkeit
habend, Tumoren auszulösen) der mit p75 bzw. Leervektorkontrolle
transfizierten Zellen im Xenograft Nacktmausmodell
durch. Hierbei werden (humane) Tumorzellen unter die Haut von
immundefizienten Nacktmäusen implantiert, um zu beobachten,
ob diese Zellen tumorigen sind. Wir injizierten je 2,5 x 10 7 der
mit dem p75 Rezeptor bzw. dem Leervektor transfizierten Zellen
in je 8 bzw. 10 Mäuse. In den Mäusen, welchen die mit dem Leervektor
transfizierten Zellen verabreicht wurden, bildeten sich
innerhalb eines Monats Tumore. Im Gegensatz dazu bildeten sich
in den Mäusen, welchen p75 transfizierte Zellen implantiert wurden,
während der ganzen Beobachtungszeit von insgesamt
sechs Monaten keine Tumoren. Bei dem hier beobachteten Effekt
der p75 Rezeptor Expression auf die Tumorigenität der humanen
Neuroblastomzellen in immundefizienten Nacktmäusen handelt
es sich um einen qualitativen und nicht um einen quantitativen
Effekt, der unabhängig von der Zahl der transplantierten Zellen
war.
Zusammenfassend konnten wir in dieser Studie eine Korrelation
der Expression des p75 Neurotrophinrezeptors mit Differenzierung
und Krankheitsfreiem Überleben im Neuroblastom
zeigen. Darüber hinaus haben wir gezeigt, dass eine Expression
des p75 Neurotrophinrezeptors in Neuroblastomzellen das
Tumorwachstum im lebenden Organismus verhindert. Wir
erwarten interessante Ergebnisse von der Analyse p75-regulierter
Signalwege und Proteine, die sich als gute Kandidaten für die
Prognose und Therapie des Neuroblastoms erweisen könnten.
Literatur
Schulte, JH et al. (2008) The low-affinity neurotrophin receptor, p75, is upregulated
in ganglioneuroblastoma/ganglioneuroma and reduces tumorigenicity
of neuroblastoma cells in vivo. Int J Cancer. doi: 10.1002/ijc.24204• Schwab, M
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Lancet Oncol 4, 472-480. doi:10.1016/S1470-2045(03)01166-5• Park, JR et
al., (2008) Neuroblastoma: biology, prognosis, and treatment. Pediatr Clin
North Am 55, 97-120. doi:10.1016/j.pcl.2007.10.014
Kontakt
Dr. med. Johannes H. Schulte
Universitätsklinikum Essen, Zentrum für Kinder-
und Jugendmedizin, Klinik für Kinderheilkunde III,
Hämatologie/Onkologie, Pulmologie und Kardiologie
E-Mail: johannes.schulte@uk-essen.de
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