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18 Forschung
Abb. 2: Automatisierte Aptamerselektion. A: Innenraumansicht des BioSprint15 Roboters (Qiagen), mit dem bis zu fünfzehn Proben parallel bearbeitet werden können.
B: Transfer von magnetischen, orangefarbenen Partikeln mittels einzelner Magnetstäbe.
Bei einer Oligonukleotidlänge von bis zu 100 Basen ergibt sich
somit eine theoretische Vielfalt von ca. 10 60 Varianten. Da die Herstellung
dieser Sequenzvielfalt (Diversität) von der Stoffmenge
her praktisch nahezu unmöglich und auch nicht notwendig ist,
werden in der Startbibliothek meist nur 10 14 bis 10 15 verschiedene
Sequenzen eingesetzt.
Die meist genutzte Technologie zur Isolierung von Aptameren
aus diesen Sequenzen ist die „systematische Evolution von
Liganden durch exponentielle Anreicherung“ (SELEX, Systematic
Evolution of Ligands by EXponential enrichment). In einem iterativen
Selektionsprozess wird der Nukleinsäurepool zunächst mit
dem meist an einer festen Phase immobilisierten Target inkubiert.
Nukleinsäuren, die keine hohe Affinität zu den Zielmolekülen
besitzen, werden durch variable Waschschritte von den
Target-bindenden Nukleinsäuren getrennt. Nach Amplifikation
der affinen Nukleinsäuren durch PCR (Polymerase Chain Reaction)
inklusive einer vorgeschalteten reversen Transkription (im Falle
von RNA-Aptameren) erfolgt aus dem PCR-Produkt die Synthese
eines einzelsträngigen Nukleinsäurepools, der in einer neuen
Runde von Bindung und Separation eingesetzt wird. Unter
Erhöhung der Selektionsstringenz wird die Diversität des Nukleinsäurepools
in mehren Zyklusrunden deutlich reduziert. Am
Ende werden aus dem mit Target-Bindern angereicherten Pool
Aptamere, also Nukleinsäuren mit einer hohen Affinität und Spezifität
zum Zielmolekül, isoliert (Abb. 1).
In den letzten Jahren wurden verschiedenartige Selektionsverfahren
entwickelt, bei denen zur Separation von bindenden
und nicht bindenden Nukleinsäuren u. a. Membranfilter, Affinitätsoberflächen
und -säulen, Gel- und Kapillarelektrophoresen,
Zentrifugation oder UV-Vernetzung eingesetzt wurden.
Durch Automatisierung von einigen Methoden konnten die Aufwandszeiten
und -kosten deutlich reduziert werden. Auch in der
RiNA GmbH wurde der Selektionsprozess von Aptameren mit Hilfe
eines Roboters (BioSprint15, Qiagen) nahezu vollautomati-
siert. Einen schnellen und parallelen Durchsatz von bis zu fünfzehn
Proben ermöglichen einzelne Magnetstäbe, welche magnetische
Partikel zwischen den Reaktionsgefäßen transferieren
(Abb. 2). Durch die Kopplung eines Zielmoleküls über einen
spaltbaren Linker an magnetische Partikel wurde die Effizienz
der Separation von Bindern und Nicht-Bindern deutlich verbessert
2 .
Vorteile von Aptameren
Der universelle Einsatz von Aptameren wird durch viele nützliche
Eigenschaften begünstigt. Voraussetzung dafür ist die hohe Spezifität
und Affinität der Aptamere zu ihrem Zielmolekül. Zudem
können im Gegensatz zu Antikörpern Aptamere auf einfache
Weise enzymatisch oder kostengünstig chemisch synthetisiert
werden. Diese Synthese erlaubt zusätzlich den Einbau von vielfältigen
Modifikationen, wie beispielsweise von Fluoreszenz-
Reportermolekülen oder Affinitätstags. Um zu verhindern, dass
Aptamere als potentielle Arzneimittel schnell über die Niere filtriert
bzw. ausgeschieden werden, kann eine Kopplung an Polyethylenglykol
(PEG) erfolgen, was die Eliminationshalbwertzeit
deutlich erhöht. Die chemische Stabilität der Aptamere (Nukleinsäuren)
gegenüber Antikörpern (Proteine) macht sie außerdem
weniger sensitiv gegen physikalische oder chemische Denaturierung
und ermöglicht so den Einsatz in sehr variablen Puffersystemen.
Im Falle einer Denaturierung sind sie zudem thermisch
leicht zu regenerieren, d.h. sie können immer wieder und qualitativ
reproduzierbar in ihre stabile dreidimensionale Struktur
zurückgefaltet werden. Ein weiterer Vorteil von Aptameren gegenüber
Antikörpern ist, dass eine Generierung von Aptameren
auch gegen zelltoxische Moleküle oder Targets mit sehr geringer
Immunogenität möglich ist. Bemerkenswerterweise gibt es bisher
keinen Beweis dafür, dass Aptamere selbst eine Immunantwort
hervorrufen.
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