Wissenswertes zum Nachschlagen aus der Chemie und Biologie

Der pK a-Wert
Um den pH-Wert einer Lösung zu verändern, löst man
Stoffe, die in der Lage sind H + -Ionen an das Wasser abzugeben
(Säuren) und die H 3O + -Ionenkonzentration damit zu erhöhen
und den pH-Wert zu senken oder durch die Aufnahme von
H + -Ionen (Basen) die H 3O + -Ionenkonzentration zu senken
und damit den pH-Wert zu erhöhen. Wie überall in der Chemie
ist auch diese Reaktion eine Gleichgewichtsreaktion und
wie sehr ein Stoff in der Lage ist, dieses Gleichgewicht zur
einen oder anderen Seite zu verschieben, wird durch die Säurestärke
beschrieben. Sie berechnet sich aus der Gleichgewichtskonstanten
K = [A – ] x [H 3O + ]/[HA]
als deren negativen dekadischen Logarithmus und wird analog
zum pH-Wert, pK a-Wert genannt. Der pK a-Wert ist also
eine einfache Maßzahl für die Säurestärke eines Stoffes.
So hat Salzsäure als eine der stärksten Säuren einen pKa von
–6 und alle HCl-Moleküle bilden mit Wasser Hydroniumionen.
Bei einer schwachen Säure wie Essigsäure errechnet
sich nur noch ein pK a von 4,75 (d.h. nur sehr wenige Moleküle
bilden ein H 3O + und ein CH 3COO – -Ion) und beim bereits
basisch wirkenden HPO 4 2– -Ion ein pKa-Wert von 12,32.
Biologische Puffer
Ursprünglich wurden verschiedene anorganische Substanzen
als Puffer verwendet (z.B. Phosphat, Cacodylat, Borat,
Bicarbonat u.a.), die später durch schwache organische
Säuren ergänzt wurden. Viele dieser Puffersubstanzen haben
aber den Nachteil, dass sie nicht inert sind und das zu untersuchende
System nachhaltig beeinflussen (z.B. Hemmung
von Enzymen, Wechselwirkungen mit Enzymsubstraten usw.).
Die meisten der heute verwendeten biologischen Puffer wurden
von N.E. Good und seinen Mitarbeitern entwickelt (Good
et al. 1966, Good & Izawa 1972, Ferguson et al. 1980; „Good-
Puffer“). Es handelt sich hierbei um N-substituierte Taurin-
oder Glycin-Puffer. Diese zwitterionischen Puffer erfüllen die
meisten der Kriterien, die ein biologischer Puffer erfüllen
muss.
Meistens werden in Experimenten bereits publizierte Puffersysteme
übernommen, um einen direkten Vergleich der
Resultate zu ermöglichen. Es zeigt sich dabei immer wieder,
dass die Konditionen in Experimenten, auch in Standard-Testsystemen,
optimiert werden können (Spektrophotometrische
Überprüfung der Reinheit von Nukleinsäuren: Wilfinger et al.
1997, pK-Matched Running Buffers for Gel Electrophoresis:
Liu et al. 1999, Puffereffekte auf die EcoR__V-Kinetiken:
Wenner & Bloomfield 1999).
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Anforderungen an biologische
Puffer
Die wichtigsten Eigenschaften von Puffern im
Überblick (nach Good & -Izawa 1972, Scopes
1994):
1. Löslichkeit
2. Permeabilität durch biologische Membranen
3. pK a-Wert im Mittelpunkt des Bereiches des
Testsystems
4. Änderungen des pK a-Wertes in Abhängigkeit
von der Temperatur
5. Änderungen des pK a-Wertes in Abhängigkeit
von der Verdünnung
6. Interaktion mit anderen Komponenten
(z.B. Metall-Ionen, Enzyme)
7. UV-Absorption
8. ungiftig
9. Kosten
Löslichkeit
Der Puffer soll eine hohe Wasserlöslichkeit und geringe
Löslichkeit in anderen Lösungsmitteln besitzen. Je höher die
Wasserlöslichkeit ist, desto einfacher ist die Herstellung
konzentrierter Stammlösungen (häufig 10X, 50X oder 100X
Stammlösungen). Der pH-Wert von konzentrierten Stammlösungen
kann sich bei Verdünnungen ändern. Zum Beispiel
steigt der pH-Wert eines 100 mM Natriumphosphat-Puffers
von 6,7 auf 6,9 bei 10facher Verdünnung und auf 7,0 bei
100facher Verdünnung (Tipton & Dixon 1979). Der pH-Wert
einer Tris-Lösung fällt um 0,1 pH-Einheit pro 10fache Verdünnung.
Permeabilität
Der Puffer sollte nicht durch biologische Membranen
permeieren, um eine Konzentrierung innerhalb der Zelle/Organelle
zu verhindern. Tris ist relativ gut fett-löslich und kann
daher durch Membranen gelangen. Dies erklärt auch seine
Toxizität für viele Säugerzellen in Kultur.
Ionenstärke
Der Puffer soll die Ionenstärke des Systems möglichst
nicht verändern. Die physiologische Ionenstärke liegt bei