Wissenswertes zum Nachschlagen aus der Chemie und Biologie

Hinweise zur Einstellung des pH-Wertes eines Puffers
Temperatur
Der pH-Wert eines Puffers kann sich je nach Puffer-
substanz in Abhängigkeit der Temperatur ändern. Es
empfiehlt sich daher den pH-Wert möglichst bei der
Temperatur einzustellen, bei der später gearbeitet
werden soll. In den meisten tierischen Zellen liegt der
physiologische pH-Wert bei 37°C im Bereich von
pH 7,0 – 7,5. Ein besonders stark Temperatur-abhängiger
Puffer ist das Tris (s.o.). Eingestellt auf 7,5 bei
37°C steigt er temperatur-abhängig im Testsystem bei
0°C auf ca. 8,5. Bei 0°C wird häufig mit Zellextrakten in
vitro gearbeitet (Scopes, 1994). Good-Puffer sind gene-
rell gering Temperatur-sensitiv, Carboxylsäure-Puffer
(Citrat, Format, Succinat) sogar noch weniger. Für die
praktische Arbeit bedeutet das, dass der einzustellende
Puffer auf die entsprechende Temperatur gebracht
(Scopes 1994, Kapitel 12.3) und die pH-Elektrode ent-
sprechend bei der Arbeitstemperatur geeicht werden
sollte. Viele pH-Meter haben heute eine Funktion inte-
griert, die ein Einstellen des pH-Wertes bei Raumtemperatur
für abweichende Arbeitstemperaturen (z.B. +4°C
oder +37°C) zulässt. Eine Einschränkung erfährt diese
Vorgehensweise jedoch dadurch, dass der dpK a/dT-Wert,
d.h. der Wert für die Änderung des pK a-Wertes (dpK a)
in Abhängigkeit von der Temperaturänderung (dT), nicht
für alle Puffer gleich ist. Zum Beispiel ändert sich der
pK a-Wert des Tris bei Erhöhung um 1°C um 0,028 Ein-
heiten und der des HEPES nur um 0,014 Einheiten.
Ungenauigkeiten sind bei diesem Verfahren unvermeid-
lich, da diese Werte eigentlich vom pH-Meter berücksichtigt
werden müssten.
Titration
Der pH-Wert wird in der Regel mit NaOH/KOH bzw.
HCl eingestellt. Bei langsamer Zugabe der Säure oder
Lauge unter starkem Rühren wird verhindert, dass lokal
eine hohe Konzentrationen an H + - bzw. OH – -Ionen auftritt.
Andernfalls können Puffersubstanzen chemisch
so verändert werden, dass sie inaktiviert werden oder
in modifizierter Form hemmend wirken können (Ellis &
Morrison 1982). Wenn von einem Puffer die protonierte
(Säure) und nichtprotonierte (Base) Form zur Verfügung
stehen, kann der pH-Wert auch durch Mischen
der beiden Substanzen eingestellt werden.
Falls monovalente Kationen stören oder untersucht
werden sollen, kann der pH-Wert mit Tetramethyl- oder
Tetraethyl-ammonium-Hydroxid eingestellt werden.
Anstelle von HCl können Acetat, Sulfat oder Glutamat
verwendet werden, wobei besonders hier die Gefahr
der Beeinflussung eines Enzyms besteht.
Ionenstärke
Wie bei der Einstellung des pH-Wertes, sollte auch bei
der Wahl des Elektrolytes für die Einstellung der Ionenstärke
der Pufferlösung (falls notwendig) vorgegangen
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werden, da sie in Abhängigkeit des verwendeten Elektrolyts
steigt. Die Salze des Tetramethyl- bzw. Tetra-
ethylammonium sind zum Einstellen der Ionenstärke
geeignet, da die großen Kationen schlechter mit den
negativen Ladungen der Enzyme interagieren können.
Acetat als großes Anion interagiert seinerseits schlecht
mit den Alkalimetallen (Ellis & Morrison 1982). Am folgenden
Beispiel des Puffers Triethanolamin (20 mM,
pH 7,5) soll verdeutlicht werden, wie das unterschiedliche
Ansetzen eines Puffers Einfluss auf die Ionenstärke
(I) nimmt. Wenn 20 mM Triethanolamin mit HCl auf den
pH-Wert 7,5 eingestellt wird, ergibt sich eine Ionen-
stärke von I = 0,012. Es liegen die Ionen H-Triethano-
lamin + und Cl – vor. Andererseits, wenn man 20 mM
Triethanolamin-Hydrochlorid mit NaOH auf den pH-
Wert 7,5 einstellt, erhält man eine Ionenstärke von
I = 0,020, da die Pufferlösung auch 8 mM NaCl enthält
(Scopes 1994). Als weiteres Beispiel sei nochmals der
Elektrophoresepuffer für SDS-PAGE erwähnt, der aus
Tris-Base mit HCl und nicht aus Tris-Hydrochlorid und
NaOH hergestellt wird (Ausubel et al. 1995).
Pufferzusätze
Werden andere Komponenten zum Puffer zugegeben
(z.B. EDTA, DTT, Mg 2+ ), ist mit Änderungen des pH-Wertes
zu rechnen und er sollte nachgemessen werden.
In der lebenden Zelle wird insbesondere durch Glutathion
die Oxidation von Proteinen durch verschiedene
Substanzen verhindert. Bei Aufschluß von Zellen muss
deshalb in der Regel ein reduzierendes Agens, b-Mercaptoethanol
(5 – 20 mM) oder DTT (1 – 5 mM), zugegeben
werden. Bereits 24 Stunden nach Zugabe zum
Puffer ist b-Mercaptoethanol oxidiert. Es empfiehlt sich
daher diese Substanz nur während der Aufarbeitung
von Proteinen in den Puffer einzuschließen und für längere
Lagerung des Proteins auf DTT zurückzugreifen.
Um das Wachstum von Bakterien oder Pilzen zu verhindern,
besonders in Puffern im Bereich pH 6,0 – 8,0,
empfiehlt sich eine Sterilfiltration (0,22 µm) bzw. die
Zugabe von 0,02 % (3 mM) Natriumazid. Letzteres wird
bei Zugabe zu konzentrierten Stammlösungen im Zuge
der Verdünnung zur Arbeitskonzentration ebenfalls so
stark verdünnt, dass es in der Regel nicht mehr stört.
pH-Meter-Kontrolle
Bei der Einstellung des pH-Wertes eines Puffers
stehen heute in der Regel akkurate pH-Meter mit digi-
taler Anzeige zur Verfügung. Das pH-Meter wird mit
zwei pH-Standards kalibriert, die den Bereich des einzustellenden
Puffers einschließen. Falls Zweifel an der
Messgenauigkeit bestehen, kann dies einfach durch
Standardisieren des pH-Meters mit einem 50 mM
Phosphat-Puffer erfolgen, der dann 10fach verdünnt
wird. Der pH-Wert sollte jetzt um 0,2 pH-Einheiten
höher liegen (Scopes 1994).