JuSER - Forschungszentrum Jülich

Diskussion: 3,4-trans-CHDführen, dass dieses Produkt eine inhibierende Wirkung auf die Biosynthese hat. Da 3,4-trans-CHD aber kein Endprodukt oder Intermediat der Aromaten-Biosynthese ist, sollte eineinhibierende Wirkung dieses Moleküls unwahrscheinlich sein. Aufgrund der analogenStruktur des Moleküls 3,4-trans-CHD im Vergleich zu den Intermediaten 2,3-trans-CHD, 2,3-Benzoesäure und der Chorismat-Abbauprodukte könnten hohe 3,4-trans-CHD-Konzentrationen die Biosynthese trotzdem beeinflussen.Die Ausbeute bei der L-Phenylalanin-Fermentation lag integriert über die Zeit bei 1,4 (2,3-CHD) bis 3,7 %mol/mol (3,4-CHD) niedriger. Die höhere Selektivität bei CHD-Molekülenkann möglicherweise durch die Abspaltung von Pyruvat auf dem Weg von Chorismat zu 2,3-und 3,4-trans-CHD erklärt werden (Abb. 3.4). Die höhere Akkumulation von Pyruvat könntedie Umsetzung von Pyruvat zu Phosphoenolpyruvat durch das Enzym PEP-Synthaseverstärken. Die höhere Verfügbarkeit von Phosphoenolpyruvat wiederum könnte für dieBiosynthese von DAHP eingesetzt werden und dadurch die CHD-Ausbeute verbessern.Bei der Synthese des Intermediats der Aromaten-Biosynthese 3-Dehydroshikimat wurde imVergleich zu den CHD-Fermentationen eine höhere Produktbildung und eine integraleAusbeute von 26 %mol/mol erreicht (Tab. 6.2). Die unbekannten Mutationen des3-Dehydroshikimat-Überproduzenten lassen einen direkten Vergleich der unterschiedlichenProzesse nicht zu. Eine Überexpression des Transketolase-Gens kann anhand derErgebnisse von Yi (Yi et al. 2003) jedoch als signifikant für eine optimale Bildung undAusbeute aller Aromaten-Biosynthese Produkte betrachtet werden.6.2.313 C-MarkierungsexperimentWährend der CHD-Fermentationen wurde in der Wachstumsphase eine spezifischeProduktbildungsrate von über 0,5 mmol/(g*h) gemessen. Nachdem das Wachstum derZellen durch die Reduktion der Aminosäurenzugabe verlangsamt wurde, fiel der Wert zuerstunter 0,3 mmol/(g*h) und im weiteren Verlauf der Fermentation unter 0,2 mmol/(g*h). Dertypische Verlauf der biomassespezifischen 3,4-trans-CHD-Bildungsrate kann der Abbildung6.5 entnommen werden.Es konnte ein Zusammenhang zwischen der Wachstums- und der Produktbildungsratehergestellt werden (Kap. 5.2.5). Eine weitere Information zur Beurteilung der Fermentationkann der Kohlenstoffbilanz entnommen werden (Abb. 6.18). In der Wachstumsphase betrugder Anteil des Nebenproduktes Kohlendioxid ca. 40 Mol% bei einer Bildungsrate von ca.6 mmol/(g*h) (Abb. 6.5). Anhand all dieser Daten konnte eine genaue qualitative undquantitative Aussage über die Ursache der Veränderungen der extrazellulären Werte jedochnicht getroffen werden. Es war deshalb notwendig, weitere Informationen über dieintrazellulären Flüsse zu gewinnen. Dieses Vorhaben sollte im Rahmen des13 C-Markierungsexperimentes umgesetzt werden. Die Zielsetzung des Experimentes war dieUntersuchung der Produktbildung und der intrazellulären Flussverteilung während einer Fed-Batch Fermentation. Eine ähnliche Fragestellung trat bei der Untersuchung derL-Phenylalanin-Biosynthese auf (Gerigk 2001; Rüffer 2004). Das 13 C-Markierungsexperimentwurde dabei mittels der Master-Sensor-Technik durchgeführt (El Massaoudi 2003). Eines derErgebnisse dieser Untersuchungen war der Hinweis auf die Erhöhung des Flusses in denTCA-Zyklus von 114 Mol% in der Wachstumsphase auf 160 Mol% in der Produktionsphase(Wahl 2005; Wahl 2006; Wahl et al. 2004). Diese Veränderung der intrazellulären Flüsse warverbunden mit der Erhöhung der Kohlendioxidbildung um 16% und der Reduktion des99