JuSER - Forschungszentrum Jülich

Ergebnisse: 2,3-trans-CHD5 Ergebnisse und Diskussion der Prozessentwicklung des fermentativenZugangs zum 2,3-trans-CHDIn den nachfolgenden Kapiteln werden die Ergebnisse der Prozess- und Stammentwicklungzur Biosynthese von 2,3-trans-CHD präsentiert und diskutiert. Der Schwerpunkt der Arbeitenlag in der Erhöhung der Produktbildung und der Vermeidung der Akkumulation vonNebenprodukten. Die Lösung einzelner Problemstellungen ist beispielhaft für die Fortschritteder modernen „weißen“ Biotechnologie.5.1 Entwicklung des FermentationsverfahrensDas Produkt 2,3-trans-CHD kann, ausgehend von Chorismat, durch zwei enzymatischeReaktionsschritte gebildet werden (Abb. 3.5). Dabei katalysiert das Enzym Isochorismat-Synthase, das durch das Gen entC kodiert wird, die Synthese von Chorismat zuIsochorismat. In einem weiteren Reaktionsschritt wird Isochorismat zu 2,3-trans-CHD durchdie Abspaltung von Pyruvat umgesetzt. Diese Reaktion wird durch das EnzymIsochorismatase (Gen entB) katalysiert (Gehring et al. 1997). Die Produktion von2,3-trans-CHD kann durch die plasmidkodierte Überexpression der Gene entB und entCerreicht werden. Die Ergebnisse von Franke (Franke 2002) zeigten, dass eine fermentativeSynthese von 2,3-trans-CHD unter Einsatz von E. coli-Produktionsstämmen erfolgreich biszu einer Produktkonzentration von 29 mmol/l (4,6 g/l) durchgeführt werden konnte.5.1.1 Suche nach einem geeigneten 2,3-trans-CHD-ÜberproduzentenDer E. coli Stamm 4 (F4) wurde für die Untersuchung der Biosynthese der aromatischenAminosäure L-Phenylalanin entwickelt (Bongaerts et al. 2001; Gerigk 2001). Durch dieTransformation des Plasmids pDF3 in diesem Stamm wurde der erste 2,3-trans-CHD-Überproduzent hergestellt. Durch den Einsatz des Stammes F4pDF3 (Tab. 4.1) in einem7,5 Liter Bioreaktor (Kap. 4.3.1) konnte das Produkt 2,3-trans-CHD bis zu einerKonzentration von 57 mmol/l (8,9 g/l) fermentativ akkumuliert werden.Der weitere Entwicklungsschritt auf dem Weg zu einem optimalen 2,3-trans-CHD-Produzenten wurde mit dem Stamm F82pC20 gesetzt. In den Arbeiten von Frost (Frost1994), Gerigk (Gerigk 2001) und Rüffer (Rüffer 2004) konnte gezeigt werden, dass dieplasmidkodierte Überexpression des Enzyms DAHP-Synthase, das durch das Gen aroF wtkodiert wird, eine Voraussetzung für eine effektive Überproduktion aromatischerAminosäuren ist. Deshalb wurde in dem Stamm F82pC20 dieses Gen plasmidkodierendüberexprimiert. Die Voraussetzung für die optimale CHD-Biosynthese beim Einsatz desGens aroF wt war die Limitierung der L-Tyrosinkonzentration, da L-Tyosin feedbackinhibierendauf die DAHP-Synthase wirkt (Kap. 3.1.3). Das machte den Einsatz einesRegelungssystems während der Wachstumsphase erforderlich. Es wurde die heuristischeindirekte Regelung der L-Tyrosinzufuhr eingesetzt (Kap. 4.3.7). Um einen möglichen Abflussdes Intermediats Chorismat in Richtung von Enterobactin zu vermeiden, wurde zusätzlichdas ent-Operon des E. coli-Produktionsstammes deletiert. Zusätzlich zu den Genen aroF wt ,entB und entC wurden die Gene aroB und aroL in das Plasmid pC20 integriert. Diese Gene57