JuSER - Forschungszentrum Jülich

Stand des Wissens3.5 Grundlagen der „Metabolischen Stoffflussanalyse“Die Anwendung der „Metabolic Engineering“-Methoden führt zur Optimierung derStoffwechselvorgänge in Mikroorganismen. Eine quantitative Beurteilung dieser Vorgängekann durch den Einsatz der metabolischen Stoffflussanalyse (MFA) erreicht werden(Wiechert et al. 1996). Die gewonnenen Daten bilden die Basis für die Quantifizierung derintrazellulären Flüsse. Die ermittelten Flüsse ermöglichen die Identifizierung möglicherAbflussengpässe. Damit können unter anderem Hinweise für eine gerichtete gentechnischeVeränderung der untersuchten Stämme gesammelt werden. Diese Veränderungen könnenmit Hilfe weiterer MFA-Experimente überprüft werden. Dadurch kann eine gerichteteStammverbesserung erreicht werden.3.5.1 Praktische Umsetzung der 13 C-StoffflussanalyseDurch die Verstoffwechselung von13 C-Glukose wird in der Biomasse dieMarkierungsinformation verteilt. Der Markierungszustand verändert sich im Laufe desExperiments vom isotopisch instationären bis zum stationären Zustand (Abb. 3.12) (Wiechert1996). Dieses Gleichgewicht kann bei dem intrazellulären Metaboliten nach ca. einer Stundeund in der Biomasse nach ungefähr zwei bis drei Stunden erreicht werden. Durch dasgezielte Variieren der Position der 13 C-Markierung an einer oder mehreren Positionen desKohlenstoff-Gerüstes können unterschiedliche Informationen über die intrazellulären Flüssegewonnen werden (Wiechert 1996).Nach Erreichen des isotopisch stationären Zustands werden die Zellen zur Analyse desProteoms hydrolysiert und für die Messung aufbereitet (Bacher et al. 1999). Für eineUntersuchung der Metabolite mittels LC-MS/MS müssen die Zellen mit -70°C kaltemMethanol gequencht werden, um die Stoffwechselaktivitäten der Organismen sofort zustoppen. Im Anschluss werden die Zellen zur intrazellulären Bestimmung des Zellinhaltsabgetrennt und aufgeschlossen.Die Bestimmung der intrazellulären Flüsse erfolgt aus den gemessenen extrazellulärenFlüssen der Produktbildungsraten, Substratverbrauchsraten und der13 C-Markierungsinformation (Abb. 3.12). Die intrazelluläre Markierung durchläuft einen isotopischinstationären Markierungszustand und geht in einen isotopisch stationärenMarkierungszustand über.34