Povestea revenirii mele - uefiscdi

Scurtă prezentare a proiectului de cercetare
Proiectul nostru s-a ocupat de un subiect important
din domeniul protein fosfatazelor. Fosforilarea
proteinelor la resturi de tirozina participă în
numeroase căi de semnalizare celulară importante
pentru activităţi celulare ca motilitatea, metabolismul,
diferenţierea, creşterea celulară şi proliferarea. Noi
am studiat protein tirozin fosfataza ce conţine un
domeniu histidinic (HD-PTP), o proteină ale cărei
funcţii nu se cunosc încă. Această proteină care
funcţionează în citoplasmă are o structură multimodulară:
are un domeniu Bro1 şi un domeniu coiled-coil
către capătul ei N-terminal, un domeniu bogat în prolina,
care este numit şi domeniu histidinic, în centrul
moleculei, un domeniu similar cu un domeniu tirozin
fosfatazic şi două secven e bogate în prolina, acid
glutamic, serina şi treonina către capătul C-terminal.
Această structură modulară sugerează că această
proteină ar putea juca un rol de proteină de esafodaj,
conectând şi reglând mai multe căi de semnalizare.
Scopul nostru de lungă durată este de a descoperi
funcţiile acestei proteine în celula şi în dezvoltarea
embrionară.
Proiectul nostru a avut trei obiective. Primul a fost
de a izola şi identifica proteine care interacţionează cu
HD-PTP in vivo. Al doilea obiectiv a fost de a exprima
şi purifica domeniul catalitic al proteinei şi de a analiza
activitatea sa fosfatazică in vitro. Al treilea obiectiv a
fost să identificăm domeniile structurale responsabile
de localizarea veziculară a proteinei. Pentru atingerea
primului obiectiv, am aplicat un protocol de studiere a
interacţiilor proteină-proteină în drojdii, folosind ca
“momeală” proteina HD-PTP fuzionată cu domeniul de
legare a DNA al factorului de transcriptie LexA. În
testele noastre am găsit patru interactori: proteina
adaptoare GRAP2, proteina ce conţine un motiv de
legare a RNA, o proteină de legare a receptorului pentru
factor de creştere şi IgA2. În continuare efectuăm
experimente care să confirme în celule de mamifere
aceste interacţii. Datele obţinute în cadrul obiectivului
second au arătat că domeniul catalitic al HD-PTP nu
poate hidroliza in vitro substrate caracteristice pentru
protein fosfataze (para-nitrofenil fosfatul) sau pentru
fosfatidilinozitol fosfataze (fosfatidilinozitol fosfati).
Această lipsă de activitate in vitro ar putea fi explicată
de existenţa unor substituţii importante în centrul
catalitic activ al HD-PTP comparativ cu secvenţele
fosfatazelor clasice. Într-un experiment de co-precipitare
cu lizate celulare pretratate cu pervanadat, am
găsit câteva proteine fosforilate care s-au legat de
domeniul catalitic purificat. Identificarea acestor proteine
va putea aduce indicii noi cu privire la mecanismele
în care este implicata HD-PTP.
O descoperire importantă făcută în timpul proiectului
a fost identificarea domeniului structural responsabil
de asocierea proteinei cu vezicule intracelulare.
Proteina supraexprimata în celule embrionare
HEK293 sau în celule de carcinom ovarian HeLa
Summary of the project
Our project investigated an important subject in
the phosphatases field. Tyrosine phosphorylation participates
in a wide array of signal transduction pathways
essential for proper control of several cellular
activities, including motility, metabolism, differentiation,
cell growth and proliferation. We studied Hisdomain-containing
protein tyrosine phosphatase (HD-
PTP), a putative phosphatase whose functions are not
yet known. This cytosolic protein has a multimodular
structure: it has a Bro1-like domain and a coiled-coil
domain toward the N-terminal end, a histidine domain
that is a proline rich domain unique to this protein in
the center of its sequence, a protein tyrosine phosphatase
domain with unique key residues in its putative
catalytic motifs and two PEST motifs at its C-terminal
end. Its modular structure suggests that this protein
might play important roles as a scaffolding molecule.
Our long term goal is to find the functional roles
that this protein play in cellular homeostasis and in
development.
Our project had three main objectives. The first
one was to identify proteins that interact with HD-PTP
in vivo. The second objective was to express and purify
its catalytic domain and analyze its phosphatase
activity in vitro. The third objective was to identify
which of its structural domains were responsible for
the protein’s vesicular localization.
In order to reach our first objective we employed a
yeast two-hybrid screening protocol using as bait the
full lenght HD-PTP fused to LexA DNA binding
domain. In our screening assay we found four interactors
of HD-PTP: GRB2-related adaptor protein 2, RNA
binding motif protein 35B, growth factor receptor
bound protein 2, and IgA2. Further studies are
required to confirm that these interactions have
indeed functional relevance.
Our data obtained in the second objective showed
that in vitro the catalytic domain of HD-PTP does not
hydrolyze para-nitrophenyl phosphate or the phosphatidylinositol
phosphates. This might be explained
by the particular aminoacid residues present in the
structural motifs of the catalytic domain. Interestingly,
in an in vitro protein pull-down experiment, we isolated
several phosphorylated proteins that bound to the
catalytic domain. We observed also that the substitution
of the Cys from the consensus catalytic site of
protein tyrosine phosphatases did not change the
binding affinity for phosphorylated proteins of this
domain.
An important discovery made during the project
was the identification of the HD-PTP structural domain
that is responsible for the protein association with
intracellular vesicles. When overexpressed in HEK
293 and HeLe cells, HD-PTP appears to be dispersed
throughout the cytosol while at the same time concen-
85
Povestea revenirii mele - domeniul biologie