DRI® Ethyl Glucuronide Assay - Fisher Scientific

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Ensaio de EtG DRI ® N.º de catálogo: 10011723 (kit de 18 ml) 10011297 (kit de 68 ml) 10011226 (kit de 500 ml) Aplicação O imunoensaio enzimático de etil-glucoronido DRI ® destina-se à determinação qualitativa e semiquantitativa de etil-glucoronido na urina humana em cutoffs de 500 e 1000 ng/ml. O ensaio permite apenas a obtenção de um resultado de teste analítico preliminar. É necessário utilizar um método alternativo mais específico para obter um resultado analítico confirmado. A cromatografia gasosa/cromatografia líquida - espectrometria de massa (GC/MS) e a espectrometria líquida/espectrometria de massa em tandem (LC/MS/MS) são os métodos de confirmação preferidos. Qualquer resultado de teste que envolva o uso de estupefacientes deverá ser alvo de consideração clínica e de avaliação profissional, sobretudo quando são usados resultados preliminares positivos. Resumo e explicação do teste O etil-glucoronido (EtG) é um metabolito directo do etanol, que se forma pela conjugação enzimática de etanol com ácido glucurónico. 1,2 O álcool na urina é geralmente detectado durante apenas algumas horas, enquanto o EtG pode ser detectado até vários dias, mesmo após a eliminação total do álcool do organismo. 3 Por conseguinte, o EtG pode ser um útil biomarcador de diagnóstico para a determinação de consumo recente de álcool e para a monitorização de abstinência em alcoólicos sujeitos a programas de tratamento para a abstinência alcoólica. 4-7 O etanol pode ser produzido in vitro pela fermentação de amostras de urina que contenham açúcares (diabetes), bactérias ou leveduras, quando as amostras são expostas a temperaturas elevadas. 8 Nestes casos, o teste de EtG pode ser utilizado como um teste de confirmação para determinar se o álcool da amostra se deve a consumo de álcool ou se foi formado in vitro em resultado de fermentação. Actualmente, o EtG é monitorizado pelos métodos GC/MS e LC/MS/MS. 9-10 O ensaio de etil-glucoronido DRI ® é fornecido como um imunoensaio enzimático homogéneo líquido pronto a utilizar. O ensaio utiliza anticorpos específicos que podem detectar etil-glucoronido sem qualquer reacção cruzada significativa com outros compostos de glucoronido. O ensaio baseiase na competição entre um fármaco marcado com glucose-6-fosfato desidrogenase (G6PDH) e um fármaco livre da amostra de urina para uma quantidade fixa de locais de ligação a anticorpos específicos. Na ausência de fármaco livre na amostra, o anticorpo específico liga-se ao fármaco marcado com G6PDH e provoca uma diminuição da actividade enzimática. Este fenómeno estabelece uma relação directa entre a concentração de fármaco na urina e a actividade enzimática. A enzima activa converte o NAD em NADH, provocando uma alteração da absorvância que pode ser avaliada espectrofotometricamente a 340 nm. Reagentes Reagente de anticorpo/substrato: Contém anticorpo anti-etil-glucoronido monoclonal de rato, glucose-6-fosfato (G6P), e nicotinamida adenina dinucleótido (NAD) em tampão Tris com azida de sódio como conservante. Reagente de conjugado enzimático: Contém derivado de etil-glucoronido marcado com glucose- 6-fosfato desidrogenase (G6PDH) em tampão Tris com azida de sódio como conservante. Materiais adicionais necessários (vendidos separadamente): 10011207, calibrador negativo de etil-glucoronido DRI ® , 25 ml 10011208, calibrador de etil-glucoronido DRI ® 100 ng/ml, 10 ml 10011210, calibrador de etil-glucoronido DRI ® 500 ng/ml, 10 ml 10011212, calibrador de etil-glucoronido DRI ® 1000 ng/ml, 10 ml 10011213, calibrador de etil-glucoronido DRI ® 2000 ng/ml, 10 ml 10012135, controlo de etil-glucoronido DRI ® 375 ng/ml, 25 ml 10012136, controlo de etil-glucoronido DRI ® 625 ng/ml, 25 ml 10012137, controlo de etil-glucoronido DRI ® 750 ng/ml, 25 ml 10012138, controlo de etil-glucoronido DRI ® 1250 ng/ml, 25 ml Precauções e advertências 1. Este teste destina-se exclusivamente a diagnóstico in vitro. Os reagentes são nocivos por ingestão. 2. Os reagentes utilizados nos componentes do ensaio contêm azida de sódio, que pode reagir com as canalizações de chumbo ou cobre, formando azidas metálicas potencialmente explosivas. Quando eliminar estes reagentes, irrigue sempre com um grande volume de água de forma a impedir a acumulação das azidas. 3. Não utilize reagentes depois da data de validade indicada. Preparação e conservação dos reagentes Os reagentes estão prontos a utilizar; não é necessária qualquer preparação adicional. Os reagentes devem ser conservados entre 2 e 8 °C. Todos os componentes do ensaio, abertos ou por abrir, são estáveis até à data de validade indicada nos respectivos rótulos. Não utilize os reagentes depois da data de validade indicada. Colheita e manipulação de amostras Proceda à colheita de amostras de urina em recipientes de plástico ou de vidro. Recomendam-se amostras de urina recentes. As Mandatory Guidelines for Federal Workplace Drug Testing Programs (normas federais norteamericanas obrigatórias para programas de análises de drogas no local de trabalho) recomendam que as amostras que não sejam testadas no prazo de 7 dias após a chegada ao laboratório sejam conservadas em unidades de refrigeração acondicionadas. As amostras de urina devem ser conservadas refrigeradas em todas as circunstâncias. As amostras com um limite de pH entre 4,5 e 11 são adequadas para teste neste ensaio. 16 Para utilização em diagnóstico in vitro Devem encetar-se todos os esforços para manter as amostras pipetadas sem resíduos grosseiros. Centrifugue as amostras altamente turvas antes da análise. A adulteração das amostras de urina pode provocar resultados errados. Caso haja suspeita de adulteração, obtenha outra amostra e envie ambas as amostras para testar no laboratório. Trate todas as amostras de urina como potencialmente infecciosas. Procedimento do ensaio Para a realização deste imunoensaio podem ser utilizados analisadores de química clínica que permitam a manutenção de uma temperatura constante, a pipetagem de amostras, a mistura dos reagentes, a medição das velocidades enzimáticas a 340 nm e a temporização rigorosa da reacção. Antes de realizar o ensaio, consulte as instruções específicas da aplicação de cada analisador para conhecer os parâmetros químicos. Controlo de qualidade e calibração As boas práticas laboratoriais sugerem a utilização de amostras de controlo para garantir o desempenho adequado do ensaio. Certifique-se de que os resultados de controlo se encontram dentro do intervalo estabelecido, conforme determinado pelos procedimentos e directrizes do laboratório. Se os resultados estiverem fora dos intervalos estabelecidos, os resultados do ensaio são inválidos. Para a análise qualitativa, utilize um calibrador de 500 ng/ml ou 1000 ng/ml como nível de cutoff. Para a análise semiquantitativa, utilize todos os calibradores. Todos os requisitos de CQ devem ser realizados em conformidade com as regulamentações locais, estatais e/ou federais ou os requisitos de acreditação. Resultados e valores esperados Qualitativo Os calibradores de 500 ng/ml ou de 1000 ng/ml podem ser utilizados como referência de cutoff para distinguir entre amostras “positivas” e “negativas”. Uma amostra que apresente uma alteração do valor de absorvância (∆A) igual ou superior ao valor obtido com calibrador de cutoff é considerada positiva. Uma amostra que apresente uma alteração do valor de absorvância (∆A) inferior ao valor obtido com o calibrador de cutoff é considerada negativa. Semiquantitativo É possível obter-se uma estimativa aproximada da concentração de fármaco nas amostras através da utilização de uma curva-padrão utilizando todos os calibradores e quantificando amostras retiradas desta curva. Quando a concentração de EtG na amostra for superior ao calibrador mais elevado, a amostra pode ser diluída com o calibrador negativo e testada novamente. Intervalo reportável O ensaio de etil-glucoronido DRI ® foi concebido para utilização semiquantitativa no intervalo entre 100 ng/ml, o calibrador mais baixo, e 2000 ng/ml, o valor do calibrador mais alto. Limitações 1. Um resultado positivo utilizando o ensaio de etil-glucoronido DRI ® é indicativo apenas da presença de etil-glucoronido e não se correlaciona necessariamente com a extensão dos efeitos fisiológicos e psicológicos. 2. As características de desempenho do ensaio de etil-glucoronido DRI ® não foram estabelecidas com fluidos corporais para além da urina humana. 3. Este ensaio de etil-glucoronido DRI ® foi validado em analisadores utilizando uma lavagem de células integral. Se o seu analisador não dispuser de uma lavagem de células integral, contacte o seu representante local da Thermo <strong>Fisher</strong> <strong>Scientific</strong>. 4. Deve ter cuidado ao apresentar resultados visto existirem vários factores, p. ex., ingestão de líquidos e outros efeitos biológicos, que podem influenciar o resultado do teste de urina. 5. É possível que outras substâncias, para além das investigadas no estudo de especificidade, possam interferir com o teste e provocar resultados falsos. Características de desempenho típicas Os dados do desempenho típico, obtidos no analisador Hitachi 917, são apresentados abaixo. Os resultados obtidos no seu laboratório poderão ser diferentes. Para obter mais dados sobre o desempenho específico do analisador, consulte a folha da aplicação específica do analisador. Precisão Os controlos de etil-glucoronido DRI ® (375, 625, 750 e 1250 ng/ml) e os calibradores de cutoff (500 e 1000 ng/ml) foram testados no modo qualitativo (mA/min) e semiquantitativo (ng/ml) utilizando um protocolo do NCCLS modificado. Os resultados apresentados abaixo foram conseguidos através de testes a todas as amostras em replicados de 6, duas vezes por dia, durante 10 dias. Qualitativo (mA/min) Calibrador/Controlo Cutoff de 500 ng/ml N=120 375 500 625 Precisão no mesmo ciclo Precisão total Média DP CV% Média DP CV% 392 417 439 2,1 2,1 2,0 0,5 0,5 0,5 392 417 439 2,9 3,1 2,7 0,7 0,7 0,6
Qualitativo (mA/min) Calibrador/Controlo Cutoff de 1000 ng/ml N=120 750 1000 1250 Semiquantitativo (ng/ml) Precisão no mesmo ciclo Precisão total Média DP CV% Média DP CV% 461 494 524 2,4 2,7 2,7 0,5 0,6 0,5 461 494 524 Calibrador/Controlo Cutoff de 500 ng/ml N=120 375 500 625 Semiquantitativo (ng/ml) 3,4 3,4 3,8 Precisão no mesmo ciclo Precisão total 0,7 0,7 0,7 Média DP CV% Média DP CV% 373 502 623 11,3 10,5 13,2 3,0 2,1 2,1 373 502 623 Calibrador/Controlo Cutoff de 1000 ng/ml N=120 750 1000 1250 18,1 19,4 22,3 Precisão no mesmo ciclo Precisão total 4,9 3,9 3,6 Média DP CV% Média DP CV% 756 993 1232 16,9 21,1 23,0 2,2 2,1 1,9 756 993 1232 31,2 34,3 43,5 Caracterização de cutoff — recuperação da concentração adicionada Os calibradores de cutoff, 500 ng/ml e 1000 ng/ml, e os controlos ±25% foram preparados através da adição de etil-glucoronido a urina negativa sem EtG. O calibrador de cutoff e os controlos foram testados (n = 21) nos modos qualitativo e semiquantitativo. Os dados qualitativos foram analisados quanto à precisão e à exactidão da detecção dos controlos e os dados semiquantitativos foram analisados quanto à percentagem de recuperação e à precisão. Os resultados indicaram que os quatro controlos foram recuperados com exactidão no modo qualitativo, os controlos negativos foram negativos (taxa inferior à taxa do calibrador C/O) e os controlos positivos foram positivos (taxa superior à taxa do calibrador C/O). No modo semiquantitativo, os controlos foram recuperados dentro de ±10% dos valores nominais. A precisão foi < 1,0% CV no modo qualitativo e < 5,0% CV no modo semiquantitativo. Interferência com substâncias endógenas A potencial interferência do pH e de substâncias fisiológicas endógenas na recuperação de etilglucoronido utilizando o ensaio de etil-glucoronido DRI ® foi avaliada adicionando quantidades conhecidas de substâncias que potencialmente interferem nos controlos ±25% para ambos os cutoffs, 500 ng/ml e 1000 ng/ml, e através do teste às amostras para recuperação de etil-glucoronido. Não se observou qualquer interferência pela adição de compostos até às concentrações abaixo indicadas. Substância que interfere Concentração final mg/dl Acetaminofeno Acetona Ácido acetilsalicílico Ácido ascórbico Ácido oxálico Albumina sérica humana Cafeína Cloreto de sódio Creatinina Etanol Galactose Glucose Hemoglobina Ibuprofeno Riboflavina Ureia pH 10 1000 10 190 30 500 10 900 400 10 10 3000 300 10 3,75 1000 4,5-11,0 4,1 3,5 3,5 17 Especificidade A reacção cruzada do composto-mãe etanol e de compostos de glucoronido, habitualmente encontrados na urina, foi testada no ensaio utilizando um calibrador de cutoff de 500 ng/ml. As soluções usadas no teste de reacção cruzada foram preparadas adicionando uma quantidade conhecida de cada composto à urina sem etil-glucoronido. Todos os compostos apresentaram um resultado negativo às concentrações discriminadas na tabela abaixo. Composto Conc. (ng/ml) Acetaldeído Ácido glucurónico Alprazolam glucoronido Buprenorfina glucoronido Butanol D-glucose Etanol Etilenoglicol Glucoronido de hidroxicumarina Glucoronido de lorazepam Glucoronido de norbuprenorfina Glucoronido de oxazepam Glucoronido de termazepam Isopropanol Metanol Metil-glucoronido Morfina-3-glucoronido Morfina-6-glucoronido n-propanol p-nitrofenil-glucoronido Testosterona Glucoronido 10,000 10,000 10,000 10,000 10,000 10,000 100,000 10,000 10,000 10,000 10,000 10,000 10,000 10,000 10,000 5,000 10,000 10,000 10,000 10,000 10,000 A reacção cruzada de compostos estruturalmente não relacionados foi testada no ensaio utilizando o calibrador de 500 ng/ml como calibrador de cutoff. Todos os compostos apresentaram um resultado negativo às concentrações discriminadas na tabela abaixo. Sensibilidade 6-acetilmorfina Acetaminofeno Ácido acetilsalicílico Amitriptilina Amoxicilina Anfetamina Benzoilecgonina Cafeína Carbamazepina Cimetidina Clomipramina Clorpromazina Codeína Desipramina Dextrometorfano Diidrocodeína Doxepina Efedrina Fenciclidina Fenobarbital Fentanil Flufenazina Fluoxetina Heroína Hidrocodona Hidromorfona Ibuprofeno Imipramina Levorfanol Maprotilina Meperidina Metadona Metronidazol Morfina Morfina-3-glucoronido Nalbufina Naltrexona Norcodeína Normorfina Nortriptilina Oxazepam Oxicodona Ranitidina Secobarbital Taluína Tebaína Tioridazina Tramadol Composto Conc. (µg/ml) 500 500 500 100 100 1000 1000 100 500 500 100 100 1000 1000 200 1000 200 2000 1000 1000 200 500 1000 1000 200 200 1000 1000 500 1000 1000 1000 500 1000 1000 1000 3000 1000 1000 500 500 500 500 1000 500 100 500 500 A sensibilidade do ensaio conforme avaliada pelo EP Evaluator 7.0 foi de 15,3 ng/ml.
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