DRI ® <strong>Ethyl</strong>glucuronid-<strong>Assay</strong> Bestellnr.: 10011723 (18ml-Kit) 10011297 (68ml-Kit) 10011226 (500ml-Kit) Anwendungsbereich Der DRI ® <strong>Ethyl</strong>glucuronid-Enzym-Immunassay ist für die qualitative and semiquantitative Bestimmung von <strong>Ethyl</strong>glucuronid in Humanurin bei Cutoffs von 500 und 1000 ng/ml vorgesehen. Dieser <strong>Assay</strong> bietet ausschließlich ein vorläufiges Analyseergebnis. Zur Bestätigung der Analyseergebnisse muss eine spezifischere Alternativmethode angewendet werden. Die bevorzugten Bestätigungsmethoden sind Gaschromatographie/Flüssigkeitschromatographie- Massenspektrometrie (GC/MS) und Flüssigkeitschromatographie/Tandem-Massenspektrometrie (LC/MS/MS). Klinische Überlegungen und eine fachliche Beurteilung sollten bei allen Drogentestergebnissen berücksichtigt werden, insbesondere bei vorläufig positiven Ergebnissen. Zusammenfassung und Erklärung des Tests <strong>Ethyl</strong>glucuronid (EtG) ist ein direkter Metabolit von Ethanol, der durch eine enzymatische Konjugation von Ethanol mit Glucuronsäure gebildet wird. 1,2 Während Alkohol normalerweise nur wenige Stunden lang im Urin nachweisbar ist, kann EtG bis zu mehreren Tagen, sogar nach vollständiger Ausscheidung des Alkohols aus dem Körper, nachgewiesen werden. 3 EtG kann deshalb als ein nützlicher diagnostischer Biomarker zur Feststellung von kürzlichem Alkoholkonsum und zur Überwachung von Abstinenz bei Alkoholikern während der Alkoholentzugsbehandlung dienen. 4-7 Wenn die Proben höheren Temperaturen ausgesetzt sind, kann Ethanol in vitro durch die Fermentierung von Urinproben entstehen, die Zucker (Diabetes), Bakterien oder Hefe enthalten. 8 Der EtG-Test kann in solchen Fällen als Bestätigungstest eingesetzt werden um nachzuweisen, ob der Alkohol in der Probe auf Alkoholkonsum zurückzuführen oder das Ergebnis von In-vitro-Fermentierung ist. EtG wird gegenwärtig durch GC/MS und LC/MS/MS überwacht. 9-10 Der DRI ® <strong>Ethyl</strong>glucunorid-<strong>Assay</strong> wird als flüssiger, gebrauchsfertiger, homogener Enzym-Immunassay geliefert. Der <strong>Assay</strong> verwendet spezifische Antikörper, die <strong>Ethyl</strong>glucuronid ohne wesentliche Kreuzreaktivität mit anderen Glucuronidverbindungen nachweisen können. Der <strong>Assay</strong> beruht auf der Konkurrenz einer mit Glukose-6-Phosphat-Dehydrogenase (G6PDH) markierten Droge und freier Droge in einer Urinprobe um eine bestimmte Menge spezifischer Antikörper-Bindungsstellen. Sollte keine freie Droge in der Probe vorhanden sein, bindet sich der spezifische Antikörper an die mit G6PDH markierte Droge und bewirkt eine Abnahme der Enzymaktivität. Durch dieses Phänomen entsteht eine direkte Beziehung zwischen Drogenkonzentration im Urin und Enzymaktivität. Das aktive Enzym wandelt NAD in NADH um, was eine Extinktionsänderung zur Folge hat, die spektrophotometrisch bei 340 nm gemessen werden kann. Reagenzien Antikörper/Substrat-Reagens: Enthält murine monoklonale Anti-<strong>Ethyl</strong>glucuronid-Antikörper, Glukose-6-Phosphat (G6P) und Nikotinamidadenindinukleotid (NAD) in Tris-Puffer mit Natriumazid als Konservierungsmittel. Enzymkonjugat-Reagens: Enthält ein mit Glukose-6-Phosphat-Dehydrogenase (G6PDH) markiertes <strong>Ethyl</strong>glucuronid-Derivat in Tris-Puffer mit Natriumazid als Konservierungsmittel. Zusätzlich benötigte Materialien (separat verkauft): 10011207, DRI ® <strong>Ethyl</strong>glucuronid- Negativkalibrator, 25 ml 10011208, DRI ® <strong>Ethyl</strong>glucuronid-Kalibrator 100 ng/ml, 10 ml 10011210, DRI ® <strong>Ethyl</strong>glucuronid-Kalibrator 500 ng/ml, 10 ml 10011212, DRI ® <strong>Ethyl</strong>glucuronid-Kalibrator 1000 ng/ml, 10 ml 10011213, DRI ® <strong>Ethyl</strong>glucuronid-Kalibrator 2000 ng/ml, 10 ml 10012135, DRI ® <strong>Ethyl</strong>glucuronid 375 ng/ml Kontrolle, 25 ml 10012136, DRI ® <strong>Ethyl</strong>glucuronid 625 ng/ml Kontrolle, 25 ml 10012137, DRI ® <strong>Ethyl</strong>glucuronid 750 ng/ml Kontrolle, 25 ml 10012138, DRI ® <strong>Ethyl</strong>glucuronid 1250 ng/ml Kontrolle, 25 ml Vorsichtsmaßnahmen und Warnhinweise 1. Dieser Test dient nur zur In-vitro-Diagnostik. Die Reagenzien sind gesundheitsschädlich beim Verschlucken. 2. Die mit den <strong>Assay</strong>-Bestandteilen verwendeten Reagenzien enthalten Natriumazid, das mit Blei und Kupfer in Wasserrohren reagieren und dabei potenziell explosive Metallazide bilden kann. Bei der Entsorgung dieser Reagenzien immer mit viel Wasser nachspülen, um eine Ansammlung von Aziden zu verhindern. 3. Die Reagenzien nicht über das Verfallsdatum hinaus verwenden. Zubereitung und Lagerung der Reagenzien Die Reagenzien sind gebrauchsfertig; eine weitere Zubereitung ist nicht erforderlich. Die Reagenzien sollten gekühlt bei 2 bis 8 °C aufbewahrt werden. Alle <strong>Assay</strong>-Bestandteile (geöffnet oder ungeöffnet) bleiben bis zum Verfallsdatum auf dem entsprechenden Etikett stabil. Die Reagenzien nicht über das Verfallsdatum hinaus verwenden. Probenentnahme und -handhabung Urinproben in Kunststoff- oder Glasbehältern sammeln. Es wird empfohlen, frische Urinproben zu verwenden. In den amerikanischen Mandatory Guidelines for Federal Workplace Drug Testing Programs wird empfohlen, Proben, die nicht innerhalb von 7 Tagen nach Eintreffen im Labor erstmals getestet werden, in gesicherten Kühleinheiten aufzubewahren. Urinproben müssen ständig gekühlt gelagert werden. Zum Testen mit diesem <strong>Assay</strong> sind Proben mit einem pH-Wert zwischen 4,5 und 11 geeignet. 4 In-vitro-Diagnostikum Pipettierte Proben sollten möglichst keine groben Verunreinigungen enthalten. Proben, die stark trübe sind, müssen vor der Analyse zentrifugiert werden. Die Verfälschung von Urinproben kann zu fehlerhaften Ergebnissen führen. Bei Verdacht auf Verfälschung sollte eine neue Urinprobe erhalten und beide Proben zur Analyse an das Labor weitergegeben werden. Alle Urinproben sind wie potenziell infektiöses Material zu behandeln. Durchführung des <strong>Assay</strong>s Zur Durchführung dieses Immunassays können Analysegeräte für die klinische Chemie verwendet werden, die in der Lage sind, eine konstante Temperatur zu halten, Proben zu pipettieren, Reagenzien zu mischen, Enzymraten bei 340 nm zu messen und den Zeitverlauf der Reaktion genau zu bestimmen. Vor Durchführung des <strong>Assay</strong>s die Angaben zu chemischen Parametern in den anwendungsspezifischen Anleitungen für jedes Analysegerät beachten. Qualitätskontrolle und Kalibrierung Es entspricht der guten Laborpraxis, Kontrollen zur Gewährleistung der ordnungsgemäßen <strong>Assay</strong>- Funktion einzusetzen. Sicher stellen, dass die Kontrollergebnisse in den durch Laborverfahren und -richtlinien festgelegten Bereich fallen. Der Test ist ungültig, wenn die Ergebnisse außerhalb des festgelegten Bereichs liegen. Zur qualitativen Analyse den Kalibrator mit 500 ng/ml oder 1000 ng/ml als Cutoff-Referenz verwenden. Zur semiquantitativen Analyse können alle Kalibratoren verwendet werden. Alle QK-Verfahren sollten entsprechend den örtlich gültigen Vorschriften und Gesetzen oder Akkreditierungsbestimmungen durchgeführt werden. Ergebnisse und erwartete Werte Qualitativ Zur Unterscheidung zwischen „positiven“ und „negativen“ Proben kann entweder der Kalibrator mit 500 ng/ml oder der mit 1000 ng/ml als Cutoff-Referenz verwendet werden. Eine Probe gilt als positiv, wenn der Extinktionsunterschied (∆A) gleich dem oder größer als der mit dem Cutoff-Kalibrator erhaltene Wert ist. Eine Probe gilt als negativ, wenn der Extinktionsunterschied (∆A) niedriger als der mit dem Cutoff-Kalibrator erhaltene Wert ist. Semiquantitativ Die <strong>Ethyl</strong>glucunorid-Konzentration in den Proben lässt sich grob abschätzen, indem mit allen Kalibratoren eine Standardkurve erstellt und die Proben anschließend relativ zur Standardkurve quantitativ bewertet werden. Wenn die EtG-Konzentration in der Probe größer als der höchste Kalibrator ist, kann sie mit dem Negativkalibrator verdünnt und erneut getestet werden. Ausgabebereich Der DRI ® <strong>Ethyl</strong>glucuronid-<strong>Assay</strong> ist für die semiquantitative Verwendung im Bereich zwischen 100 ng/ml, dem niedrigsten Kalibrator, und 2000 ng/ml, dem Wert des High-Kalibrators, angelegt. Einschränkungen 1. Ein positives Ergebnis bei der Verwendung des DRI ® <strong>Ethyl</strong>glucuronid-<strong>Assay</strong>s zeigt lediglich die Präsenz von <strong>Ethyl</strong>glucuronid an und korreliert nicht unbedingt mit dem Ausmaß physiologischer und psychologischer Wirkungen. 2. Für andere Körperflüssigkeiten als Urin sind bisher keine Leistungsdaten für den DRI ® <strong>Ethyl</strong>glucuronid-<strong>Assay</strong> erarbeitet worden. 3. Dieser DRI ® <strong>Ethyl</strong>glucuronid-<strong>Assay</strong> wurde auf Analysegeräten mit integrierter Zellwaschung validiert. Falls Ihr Analysegerät nicht mit einer integrierten Zellwaschung ausgestattet ist, wenden Sie sich an Ihre Vertretung von Thermo <strong>Fisher</strong> <strong>Scientific</strong>. 4. Bei der Weitergabe von Ergebnissen ist vorsichtig vorzugehen, da Urintestergebnisse vielen Einflussfaktoren, wie z. B. Flüssigkeitsaufnahme und anderen biologischen Faktoren unterliegen. 5. Es ist möglich, dass Substanzen, die nicht in der Spezifitätsstudie untersucht wurden, den Test stören und zu falschen Ergebnissen führen. Typische Leistungsdaten Typische, mit dem Hitachi 917 Analysegerät erhaltene Leistungsergebnisse sind unten aufgeführt. Möglicherweise unterscheiden sich die in Ihrem Labor erhaltenen Ergebnisse von diesen Daten. Weitere für das jeweilige Analysegerät spezifische Leistungsdaten sind dem Applikationsblatt des betreffenden Analysegerätes zu entnehmen. Präzision Die DRI ® <strong>Ethyl</strong>glucunorid-Kontrollen (375, 625, 750 und 1250 ng/ml) und die Cutoff-Kalibratoren (500 und 1000 ng/ml) wurden im qualitativen (mA/min) und semiquantitativen Modus (ng/ml) nach einem modifiziertem NCCLS-Protokoll untersucht. Die unten angegebenen Ergebnisse beruhen auf der Analyse aller Proben in Replikaten von jeweils 6 zweimal täglich für 10 Tage. Qualitativ (mA/min) Kalibrator/ Kontrolle Cutoff 500 ng/ml Intratestlaufpräzision Gesamtpräzision N=120 Mittelwert St.abw. VK (%) Mittelwert St.abw. VK (%) 375 500 625 392 417 439 2,1 2,1 2,0 0,5 0,5 0,5 392 417 439 2,9 3,1 2,7 0,7 0,7 0,6
Qualitativ (mA/min) Kalibrator/ Kontrolle Cutoff 1000 ng/ml Intratestlaufpräzision Gesamtpräzision N=120 Mittelwert St.abw. VK (%) Mittelwert St.abw. VK (%) 750 1000 1250 461 494 524 Semiquantitativ (ng/ml) Kalibrator/ Kontrolle 2,4 2,7 2,7 0,5 0,6 0,5 461 494 524 Cutoff 500 ng/ml 3,4 3,4 3,8 Intratestlaufpräzision Gesamtpräzision 0,7 0,7 0,7 N=120 Mittelwert St.abw. VK (%) Mittelwert St.abw. VK (%) 375 500 625 373 502 623 Semiquantitativ (ng/ml) Kalibrator/ Kontrolle 11,3 10,5 13,2 3,0 2,1 2,1 373 502 623 Cutoff 1000 ng/ml 18,1 19,4 22,3 Intratestlaufpräzision Gesamtpräzision 4,9 3,9 3,6 N=120 Mittelwert St.abw. VK (%) Mittelwert St.abw. VK (%) 750 1000 1250 756 993 1232 16,9 21,1 23,0 2,2 2,1 1,9 756 993 1232 Cutoff-Charakterisierung – Wiederfindung der Dotierung 31,2 34,3 43,5 Die Cutoff-Kalibratoren, 500 ng/ml und 1000 ng/ml, und ±25-%-Kontrollen wurden durch die Dotierung von EtG-freiem Negativ-Urin mit <strong>Ethyl</strong>glucunorid zubereitet. Der Cutoff-Kalibrator und die Kontrollen wurden sowohl im qualitativen als auch im semiquantitativen Modus getestet (n=21). Die qualitativen Daten wurden auf Präzision und Nachweisgenauigkeit der Kontrollen, und die semiquantitativen Daten auf prozentuale Wiederfindung und Genauigkeit analysiert. Die Ergebnisse zeigten an, dass im qualitativen Modus alle vier Kontrollen richtig wiedergefunden wurden: Negativkontrollen als negativ (Rate unterhalb der Cutoff-Kalibratorrate) und Positivkontrollen als positiv (Rate oberhalb der Cutoff-Kalibratorrate). Im semiquantitativen Modus wurden die Kontrollen innerhalb von ±10 % der Nominalwerte wiedergefunden. Die Genauigkeit lag bei
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