Enzygnost* Anti-HBs II - Medcorp

Enzygnost * Anti-HBs II 

Enzyme immunoassay for the qualitative and quantitative 

detection of antibodies to hepatitis B surface antigen (HBsAg) in 

serum and plasma 

Enzymimmunoassay zum qualitativen und quantitativen Nachweis 

von Antikörpern gegen Hepatitis B surface Antigen (HBsAg) 

in Serum und Plasma 

Test immunoenzymatique qui permet la mise en évidence qualitative 

et quantitative des anticorps anti-antigène de surface de 

l’hépatite B (AgHBs) dans le sérum ou le plasma 

Metodo immunoenzimatico per l’identificazione qualitativa e la 

determinazione quantitativa degli anticorpi contro l’antigene di 

superficie dell’epatite B nel siero e nel plasma. 

Prueba inmunoenzimática para la determinación cualitativa y 

cuantitativa del anticuerpo contra el antígeno de superficie de la 

hepatitis B (HBsAg) en suero y en plasma 

Determinação qualitativa e quantitativa de anticorpos contra 

_ 

o 

antigénio de superfície do vírus da hepatite B (HBsAg) no soro e 

no plasma. 

English: Page 2 to 12 

Deutsch: Seite 13 bis 22 

Français: Pages 23 à 33 

Italiano: Pagina 34 fino 44 

Español Página 45 hasta 55 

Português: Página 56 a 66 

Summary of Test Procedure Page 12 

Kurzanleitung Testdurchführung Seite 22 

La technique en bref Page 33 

Istruzioni in breve, esecuzione del Test Pagina 44 

Resumen de la técnica Página 55 

Resumo da técnica Página 66 

Bibliography/Literatur/Littérature 

Bibliografia/Bibliografía/Bibliografia Page/Seite/Pagina/Página 67 

OQNE G11 C0541 (906) H/R 1 

Edition February 2004


Intended Use 

Enzyme immunoassay for the qualitative and quantitative detection of antibodies to hepatitis B 

surface antigen (HBsAg) in serum and plasma. 

The enzyme immunoassay is processed using the BEP ® II, BEP ® III and BEP ® 2000 ELISA 

processors. The test was developed for testing individual samples, not for pooled samples. The 

product is for in vitro diagnostic use only. The product is for in vitro diagnostic use only. 

Summary and Explanation 

Like hepatitis B surface antigen (HBsAg), the anti-HBs antibody directed against the surface 

protein is an important parameter for the diagnosis of infection with hepatitis B virus (HBV) 1,2 . 

During the incubation period and in the acute phase of HBV infection, antibodies to HBsAg are 

undetectable. In 90% of all cases these anti-HBs antibodies, which provide immunity, do not 

occur until late in convalescence approx. 3 to 4 months after the onset of the disease, when 

circulating HBsAg can no longer be detected 3, 4 . 

This seroconversion, i.e. the transition from anti-HBs negative to positive, represents a very 

reliable parameter for diagnosing a past HBV infection, especially since approx. 10% of acutely 

infected patients in whom no HBsAg can be detected in the early phase later become positive for 

anti-HBs. The anti-HBs test is therefore also suitable for the diagnosis for subclinical HBV 

infections 3, 4 . 

As a positive result for anti-HBs is indicative of past exposure to this antigen - either by HBV 

infection or by vaccination, the most important applications of the anti-HBs test are as follows: 

a) assessment of convalescence and, to a certain extent, also prognosis in patients infected with 

HBV (follow-up), 

b) serological investigations in the context of vaccination programmes (screening and 

immunization check-ups), 

c) epidemiological studies. 

Besides the qualitative detection of anti-HBs, the quantitative evaluation of anti-HBs has gained 

its own relevance with regard to the aspect of active immunization. According to a 

recommendation of the WHO, a person vaccinated with a hepatitis vaccine can be assumed to 

be protected against the infection if an anti-HBs concentration of > 10 IU/L can be detected in the 

serum or plasma. Booster vaccinations in time are recommended to guarantee that the values 

are not below this limit 5, 6, 7 . 

Patients found to have anti-HBs values < 100 IU/L after the completion of basic immunization 

require booster vaccination within one year (Recommendations of the Standing Vaccination 

Comittee of the Robert Koch Institute in Germany, October 1995). 

The necessity of a quantitative assessment is furthermore underlined by the fact that the 

duration of immunity is proportional to the attained levels of anti-HBs. 

Principle of the Method 

Enzygnost * Anti-HBs II is a one-step assay based on the sandwich principle. The antigen used 

for the solid phase and conjugate is human HBsAg. 

Peroxidase-labelled HBsAg binds to the HBs-specific antibodies contained in the sample. These 

bind to the HBsAg bound to the surface of the microtitration plate (antigen sandwich). 

The unbound constituents are removed by washing and the bound enzyme activity of the 

conjugate is then determined. The enzymatic conversion of substrate and chromogen results in 

a blue colour. The reaction is terminated by the addition of Stopping Solution POD, producing a 

yellow colour. The intensity of the colour is proportional to the concentration of antibody in the 

sample. The results are quantified by calculation using the α-method or by comparison with a 

standard curve. 

OQNE G11 C0541 (906) H/R 2 Edition February 2004

Reagents 

Materials provided 

Enzygnost * Anti-HBs II 1 x 96 10 x 96 

Enzygnost * Anti-HBs II 1 test plate 10 test plates 

HBsAg/POD Conjugate (Anti-HBs II) 1 x 6 mL 10 x 6 mL 

Anti-HBs Serum 100 1 x 1.5 mL 3 x 1.5 mL 

Anti-HBs Serum, negative 2 x 14 mL 5 x 14 mL 

Washing Solution POD (Concentrate)** 1 x 100 mL 2 x 100 mL 

Buffer/Substrate TMB** 1 x 30 mL 4 x 30 mL 

Chromogen TMB** 1 x 3 mL 4 x 3 mL 

Stopping Solution POD** 1 x 100 mL 2 x 100 mL 

Empty bottle for Working Chromogen Solution 1 pcs. 1 pcs. 

Adhesive foils 6 pcs. 24 pcs. 

PE bag 1 pcs. 1 pcs. 

Barcode table of values 1 pcs. 1 pcs. 

Instructions for use 1 pcs. 1 pcs. 

Further packs: 100 x 96 

** These components are also included in the Supplementary Reagents for Enzygnost* TMB kit 

(code no. OUVP). 

Composition 

Enzygnost * Anti-HBs II (test plate): Microtitration plate coated with inactivated HBsAg 

(subtypes ad and ay) isolated from human blood. 

HBsAg/POD Conjugate (anti-HBs II): Inactivated HBsAg, peroxidase (POD)-conjugated, 

isolated from human blood, Tris (approx. 100 g/L), NaCl (approx. 47 g/L) 

Preservative: phenol (max. 1 g/L) 

Anti-HBs Serum 100: Human anti-HBs serum (nominal concentration 100 ± 25 IU/L), calibrated 

against the WHO Reference Preparation, nominal absorbance: ≥ 0.7 

Preservatives: amphotericin (approx. 5 mg/L), 

gentamicin (approx. 100 mg/L) 

Anti-HBs Serum, negative: Human serum, nominal absorbance: ≤ 0.12 

Preservatives: amphotericin (approx. 5 mg/L), 

gentamicin (approx. 100 mg/L) 

Washing Solution POD (concentrate): Phosphate buffer solution (90 mmol/L) containing 

Tween. 

Preservative: phenol (max. 1 g/L) 

Buffer/Substrate TMB: Hydrogen peroxide (approx. 0.1 g/L) in acetate buffer solution 

(25 mmol/L) 

Preservative: n-butanol (approx. 10 mL/L) 

Chromogen TMB: Tetramethyl benzidinedihydrochloride (5 g/L) 

Stopping Solution POD: 0.5 N sulfuric acid 

OQNE G11 C0541 (906) H/R 3

Warnings and Precautions 

1. For in vitro diagnostic use. 

2. Each individual blood donation for use in manufacture of the controls of Enzygnost * Anti-HBs 

II is tested for HBsAg, anti-HCV, anti-HIV1 and anti-HIV2. Only donations with negative 

findings are used for manufacture. 

Nevertheless, since absence of infectious agents cannot be proven, all materials obtained 

from human blood should be handled with due care, observing the precautions recommended 

for biohazardous material 8 . 

3. The HBsAg used in the manufacture of the test plates and POD conjugate was isolated from 

HBsAg-positive human plasmas, which were found to be negative concerning Anti-HCV, Anti- 

HIV1 and Anti-HIV2, to a high degree of purity and subjected to a recognized inactivation 

process. 

4. It is advisable to wear protective gloves throughout the entire test procedure. 

5. For disposal, it is recommended that solid infectious materials should be autoclaved for at 

least one hour at +121 °C. All aspirated liquids should be collected in two receptacles 

connected in series, which should both contain a disinfectant suitable for inactivating 

pathogenic human viruses. The concentrations and times specified by the manufacturer must 

be observed. 

Preparation of the Reagents 

Bring all the reagents and samples to +15 to +25 °C before beginning the test (without removing 

the test plate from the container). 

Test strips not needed for the test must be removed from the holder and stored for later use (see 

Table 1) 

For each test plate, dilute 20 mL of Washing Solution POD to 400 mL with distilled or deionized 

water. 

For each test plate, dilute 1 mL of Chromogen TMB with 10 mL of Buffer/Substrate TMB in 

the empty bottle supplied with the kit (= Working Chromogen Solution) and store protected from 

light. After use rinse the bottle thoroughly with distilled water. 

For technical reasons (overage) it is not permissible to transfer the contents of the Chromogen 

TMB vial into the vial of Buffer/Substrate TMB. 

Prediluting the samples: For the quantitative test, samples expected to contain anti-HBs 

concentrations of ≥ 100 IU/L should be diluted as follows: 

up to 1000 IU/L: Dilute 1:10 (e.g. 20 µL sample + 180 µL Anti-HBs Serum, negative) 

up to 10,000 IU/L: Dilute 1:100 (e.g. 20 µL sample + 180 µL Anti-HBs Serum, negative; 

20 µL thereof + 180 µL Anti-HBs Serum, negative) 

up to 100,000 IU/L: Dilute1:1000 (e.g. 20 µL sample + 180 µL Anti-HBs Serum, negative; 

20 µL thereof + 180 µL Anti-HBs Serum, negative; 

20 µL thereof + 180 µL Anti-HBs Serum, negative). 

If the quantitative evaluation of the test is performed using serial dilutions, the following dilutions 

of the Anti-HBs Serum 100 must be additionally prepared with the Anti-HBs Serum, negative 

(does not apply if evaluation is by the α-method): 

50 IU/L: 1:2 dilution (e.g. 200 µL Anti-HBs Serum 100 + 200 µL Anti-HBs Serum, negative) 

25 IU/L: 1:4 dilution (e.g. 150 µL of the 50 IU/L Serum + 150 µL Anti-HBs Serum, negative) 

10 IU/L: 1:10 dilution (e.g. 50 µL Anti-HBs Serum 100 + 450 µL Anti-HBs Serum, negative) 

5 IU/L: 1:20 dilution (e.g. 150 µL of the 10 IU/L Serum + 150 µL Anti-HBs Serum, negative) 

Storage and Stability 

Stored unopened at +2 to +8 °C, all components of the Enzygnost * Anti-HBs II kit may be used up 

to the dates of expiry given on the labels. 

Once opened or diluted ready for use, the details given in Table 1 in the Appendix apply. 

OQNE G11 C0541 (906) H/R 4

Equipment required: 

BEP ® II: For automatic dispensing of reagent and washing 

BEP ® III: For automatic processing of the test after dispensing the samples as well as for 

evaluation 

BEP ® 2000: For fully automatic processing and evaluation of the test 

Pipettes: piston-type pipettes: 25, 100 and 1000 µL. 

Incubator: Covered water bath (+37 ± 1 °C) or comparable incubation methods 

All the equipment used in the test must have been validated. 

Specimens 

Suitable specimens are individual samples (human sera or EDTA/ heparinized/citrated plasma) 

obtained by standard laboratory techniques. 

The samples should be stored for not more 3 days at 2 - 8 ° C. If the samples are to be stored for 

a longer period of time, they must be frozen. 

Procedure 

Procedure using the BEP ® II 

1. Assay scheme: Ascertain the number of wells required (= number of test samples plus 6 

wells for the controls). 

2. Dispense samples: 

Qualitative Test/Quantitative Test (α - method): 

Into 4 wells (A1 to D1) pipette 100 µL/well of Anti-HBs Serum, negative, and into one well (E1) 

100 µL of Anti-HBs Serum 100. Fill each of the subsequent wells with 100 µL/well of sample. 

At the end of the series/plate, fill one further well with 100 µL of Anti-HBs Serum 100. 

Perform the pipetting steps swiftly within 15 min per test plate. 

Important: It is NOT permitted to pipette the Anti-HBs Serum 100 into the assigned wells 

first and then to add the samples into the "gaps" between the wells. 

Quantitative Test (standard series): 

Pipette into 4 wells 100 µL/well of Anti-HBs Serum, negative, and then fill the 100, 50, 25, 10 

and 5 IU/L dilutions of the Anti-HBs Serum into 2 wells each at 100 µL/well. Fill the following 

wells with 100 µL/well of sample (prediluted if required). 

Immediately after dispensing the samples continue by dispensing the conjugate. 

3. Dispense conjugate: Pipette 25 µL of the HBsAg/POD Conjugate (Anti-HBs II) into each 

well. 

Then seal with foil and, immediately after completion of the conjugate dispensing step, place 

the plate into the incubator. 

4. Incubate: Incubate at 37 ± 1 °C for 60 ± 2 min. Then proceed immediately to the wash step. 

5. Wash: Remove the foil, aspirate all the wells and wash 4 times with approx. 0.3 mL/well of 

washing solution. After completing the wash cycles proceed immediately to the substrate 

dispensing step in order to prevent drying out of the wells. 

6. Dispense substrate: Pipette 100 µL of the Working Chromogen Solution into each well and 

seal the plate with fresh foil. 

7. Incubate: Incubate protected from light at +15 to +25 °C for 30 ± 2 min. 

8. Stop reaction: Remove foil, and add 100 µL of Stopping Solution POD to each well, keeping 

to the same timing as in Step 6. 

9. Read: Read at 450 nm within one hour. The recommended wavelength for the reference 

measurement is 650 nm (where appropriate, between 615 and 690 nm). 

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Test procedure using the BEP ® III 

Before using the BEP ® III, prepare the test plates and sample dispensing steps (Section 1 and 2 

at "Test procedure with the BEP ® II"). Immediately afterwards place the uncovered test plates 

(i.e. not covered with adhesive foil) into the BEP ® III. Note that partially filled test plates need to 

be made up to at least half plates (6 test strips) by adding "water-filled strips". The test is then 

processed fully automatically (see BEP ® III instruction manual). 

The settings for the incubation times in the BEP ® III software may differ from the times on the 

BEP ® II for technical reasons (system speed) but have been validated for Enzygnost * on the 

BEP ® III. 

Test procedure using the BEP ® 2000 

The sample dispensing steps and subsequent processing of the test are performed fully automatically 

by the analyzer (see BEP ® 2000 instruction manual). 

Validation of the test 

The individual values of the absorbances of the control sera are used for calculating the mean 

values if: 

–0.010 ≤ A neg ≤ 0.120 

A Anti-HBs Serum 100 ≥ 0.7 

If one of the four absorbance values of the negative controls is outside the specification, this 

value can be neglected. 

Both absorbance values of the Anti-HBs Serum 100 must comply with the specification. 

If these conditions are not fulfilled, the test must be repeated. 

For the quantitative test the following validation criteria apply: 

If serial dilutions are used: 

A neg ≤ A standard 5 IU/L 

If the α - method is used: 

The individual absorbance readings for the Anti-HBs Serum 100 are used to calculate the mean, if: 

lower margin < A Anti-HBs Serum 100 < upper margin 

The values for the lower and upper margins are given in the enclosed table of values. 

Both absorbance values of the Anti-HBs Serum 100 must fulfil the specification. 

In addition, the individual values must not differ by more than 20% from the mean of these two values. 

If these conditions are not met, the test can only be evaluated qualitatively. 

Evaluation 

The evaluations are performed automatically if using the BEP ® 2000 and BEP ® III. Please 

consult the relevant instruction manuals. The following sections apply if the measurements are 

carried out without using a software. 

Qualitative test: 

Calculate the mean absorbance of the negative controls, then calculate the cut-off limit by 

adding 0.08: 

– 

A neg +0.08 = Cut-off 

The test samples are classed as follows based on the criteria of the test: 

1. A sample < cut-off = Anti-HBs negative 

2. A sample ≥ cut-off = Anti-HBs positive 

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Quantitative test (α - method): 

A correction factor is calculated for each individual processed test plate and used to correct the 

absorbance reading of each sample (measurement correction). The corrected readings are then 

used to calculate the antibody activity (see "Calculation of the results"). 

Measurement correction 

The correction factor is calculated from the following formula: 

Nominal value 

Correction factor = –––––––––––––––––––––––––––– 

Mean value of Anti-HBs Serum 100 

The nominal value is given in the enclosed table of values. The absorbance readings of the test 

samples are multiplied by the correction factor. The corrected readings obtained are then used to 

calculate the results. 

If several test plates are run, the correction factor has to be determined for each plate 

separately and used to correct the readings for the appropriate plate. 

Calculation of the results 

To calculate the antibody activities the corrected readings of the samples are used in the 

following formula (α-method): 

log 10 mIU/L = α .A β 

where α and β and are lot-dependent constants given in the enclosed table of values. The 

antibody activity result in "IU/L" relates to the WHO International HBV Reference Serum. 

Important: DO NOT use the following in the formula: 

- corrected readings < cut-off 

- uncorrected readings > 2.5 

Calculation example 

Value given for α 4.8239 

Value given for β 0.1054 

Corrected reading of a test sample 0.950 

log 10 mIU/L (from above formula) gives 4.7979 (see note 1) 

and the antilog (=mIU/L) is 62790 (see note 2) 

and the antibody activity (IU/L) is 62.79 (see note 3) 

note 1: If a pocket calculator is used: input 0.950, press x Y , input 0.1054, press =, press x, input 4.8239, 

and press = 

note 2: After calculating the number in the previous line, press either the 10 X key or the INV and log keys. 

note 3: To convert to IU/L the prior number must be divided by 1000. 

If the test sample was prediluted (e.g. 1:11) for the test, then the calculated antibody activity (not 

the signal reading) must be multiplied by 11. 

Quantitative test (standard series) 

For the quantitative evaluation, calculate the mean absorbances from each pair of wells in the 

standard series (5, 10, 25, 50 and 100 IU/L) and use these values to establish a reference curve 

on double logarithmic paper. Abscissa: Anti-HBs concentration 5 to 100 IU/L. Ordinate: 

Absorbance 0.05 to 2.0. The anti-HBs concentrations of the samples can then be read from the 

reference curve on the basis of their absorbances. 

If the samples were used in diluted form, the concentration read from the reference curve must 

be multiplied by the appropriate dilution factor. 

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Limitations of the Procedure 

1. Anticoagulants such as heparin, EDTA and citrate do not interfere with the test. 

2. Samples that are lipaemic, haemolytic, icteric or contain rheumatoid factors do not impair the 

test results. 

3. In the case of samples from pregnant women, no interference with the test result was 

observed. 

4. Samples containing the following potential sources of interference were checked in the test: 

HBs antigen, ANA as well as antibodies to HCV, HAV, HBC, HBe, EBV and CMV. With the 

samples used, no interference was observed with the test result. 

5. No interferences were observed with heat-treated samples (30 min, 56 °C). 

6. Serum from insufficiently coagulated blood, contain sodium azide or microbial contamination 

should not be used. Any particulate components in the sample (e.g. fibrin clots) should be 

removed before the test. 

7. When using thawed samples, ensure good homogenization of the material prior to use. 

8. The pack contains a matched set of reagents. Reagents must not be interchanged with other 

kits unless the reagents are from an identical lot (i.e. they must display the required 6-digit lot 

numbers printed on the pack and given in the enclosed barcode table). Washing Solution 

POD, Stopping Solution POD and Working Chromogen Solution are exceptions to this 

requirement. Note that the Working Chromogen Solution must first be prepared from 

matched components (do not use Chromogen TMB and Buffer/Substrat TMB from kits with a 

different number). 

9. Buffer/Substrate TMB, the Working Chromogen Solution and the Stopping Solution POD 

must not be allowed to come into contact with heavy metal ions or oxidizing substances (do 

not use pipettes with metal parts in contact with the liquid!). Do not perform the substrate 

reaction in the proximity of disinfectants containing hypochlorite. If the Working Chromogen 

Solution has spontaneously developed a blue colour before transferral into the test plate, this 

indicates that the solution is contaminated; in such cases prepare a fresh solution in a clean 

container. Skin contact with the above-mentioned solutions is to be avoided. 

10. The control sera have been prepared from native human sera. As a result, turbidity may 

occur but this has no effect on the test result. 

11. The test plate should be protected from vibration during the incubation phase (e.g. placed on 

a secured floatation aid, or in a non-circulating water bath); the wells of the plate must be in 

contact with the thermostated water. If stabilizers are used to prevent microbial contamination 

of the water, care must be taken that neither the surface of the test plate nor the wells come 

into contact with these solutions since such contamination can lead to unspecific reactions. 

12. With highly reactive samples the dye may precipitate during the stopping reaction. This does 

not interfere with the photometric evaluation. 

13. Dade Behring has validated use of these reagents on various analyzers to optimize product 

performance and meet product specifications. User defined modifications are not supported 

by Dade Behring as they may affect performance of the system and assay results. It is the 

responsibility of the user to validate modifications to these instructions or use of the reagents 

on analyzers other than those included in Dade Behring Application Sheets or these 

instructions for use. 

14. Results of this test should always be interpreted in conjunction with the patient’s medical 

history, clinical presentation and other findings. 

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Specific Performance Characteristics 

Sensitivity and Specificity 

The results of the sensitivity and specificity studies are shown in Tables 2 + 3 (Appendix). 

The diagnostic sensitivity was established by investigating 515 anti-HBs-positive samples, and 

the sensitivity result was 100%. The reactivity of the test in respect to seroconversion samples / 

vaccination profiles was investigated using 41 profiles. Here it was found that, in detecting 

seroconversions/vaccination profiles, Enzygnost * Anti-HBs II exhibited a degree of sensitivity 

comparable with other tests. 

The analytical sensitivity of the test was established to be < 8 IU/L which was determined by 

quantitative evaluation (standard curve) using the WHO Reference Preparation. 

For establishing the specificity of the test, a total of 4736 anti-HBs-negative blood donor samples 

were investigated and the result was 99.5 to 99.7%. Different values may be obtained in relation 

to sample population, test procedure, and other factors. 

Reproducibility 

The results of the intra-/inter-assay reproducibility study are listed in Table 4 (in the Appendix). 

These are exemplary data. Differing values may be well obtained depending on various factors 

such as procedure, etc. 

* Enzygnost is a registered trademark of Dade Behring Marburg GmbH in Germany and other 

countries. 

BEP is a registered trademark of Dade Behring Marburg GmbH in the USA, in Germany and 

other countries. 

Dade Behring Marburg GmbH 

0197 

Emil-von-Behring-Str. 76 

D-35041 Marburg 

www.dadebehring.com 

USA Distributor: 

Dade Behring Inc. 

Newark, DE 19714 U.S.A. 

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Tab. 1 Storage and Stability 

Material/reagent State Storage Stability • 

Enzygnost * Anti-HBs II (Test plate) once opened +2 to +8 °C 4 weeks 

in the bag 

with the desiccant 

HBsAg/POD Conjugate (anti-HBs II) once opened +2 to +8 °C 4 weeks 

Anti-HBs Serum 100 once opened +2 to +8 °C 4 weeks 

Anti-HBs Serum, negative < -20° C 3 months 

Chromogen TMB once opened +2 to +8 °C expiry date 

Buffer/Substrate TMB once opened +2 to +8 °C expiry date 

Working Chromogen Solution diluted +2 to +8 °C 5 days 

1 + 10 +15 to +25 °C 8 hours 

in closed container 

protected from light 

Washing Solution POD (concentrate) once opened +2 to +8 °C expiry date 

diluted 1:20 +2 to +8 °C 1 week 

diluted 1:20 +18 to +25 °C 1 day 

Stopping Solution POD once opened +2 to +8 °C expiry date 

• use each component by the expiry date at the latest 

Tab. 2 Sensitivity 

The sensitivity studies, run at different sample panels, yielded the following data: 

Sample population Number Enzygnost * Anti-HBs II 

of samples 

reactive 

Anti-HBs positive (Germany) 106 106 

Anti-HBs positive (America) 52 52 

Follow-up samples 25 25 

Anti-HBs positive 100 100 

Different stages of HBV infection 41 41 

HBV vaccinees 111 111 

anti-HBs positive 80 80 

vaccination profiles 32 profiles Sensitivity equivalent 

seroconversion 9 profiles to that of 

comparable tests 

Tab. 3 Specificity 

The specificity studies, run with samples from different blood banks, yielded the following data: 

Sample population Number Enzygnost * Anti-HBs II 

of samples 

reactive 

Normal negative sera 2296 11 

Normal negative plasmas 646 2 

Normal negative sera 1508 5 

Normal negative plasmas 286 1 

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Tab. 4 Reproducibility 

In the studies on intra-assay reproducibility the samples were tested in 8-fold replicates on each 

of 5 days at two independent centres (K, E). The CV were calculated by the variance component 

model. 


Sample Mean ratio % CV 

(K) P1 0.3 13.0 

P2 1.0 5.0 

P3 3.1 2.6 

P4 11.3 2.2 

(E) F1 0.3 9.1 

F2 1.0 4.7 

F3 4.0 3.0 

F4 9.1 4.8 

F5 14.5 5.0 

In the studies on inter-assay reproducibility the samples were tested in 8-fold replicates on each 

of 5 days at two independent centres (K, E). The CV were calculated by the variance component 

model. 


Sample Mean ratio % CV 

(K) P1 0.3 8.3 

P2 1.0 4.1 

P3 3.1 2.3 

P4 11.3 3.6 

(E) F1 0.3 12.9 

F2 1.0 4.0 

F3 4.0 2.2 

F4 9.1 2.2 

F5 14.5 2.5 

Ratio = Absorbance / cut-off 

OQNE G11 C0541 (906) H/R 11

Tab. 5 Test procedure and programming 

Test procedure 

(BEP ® II, BEP ® III, BEP ® 2000) 

BEP ® II 

Prepare reagents 

4 x 100 µL Control Serum, negative 

1 x 100 µL Control Serum, positive 

100 µL per undiluted sample 

1 x 100 µL Control Serum, positive 

BEP ® III 

25 µL In the case of partially filled 

Conjugate plates: Add water-filled 

strips to make up to 

half a plate 

60 min ± 2 min 

(37 ± 1 °C) 

Wash 4x: BEP ® II 

100 µL Working Automatic 

Chromogen Solution 

processing 


+15 °C to +25 °C 

protected from light 

100 µL Stopping Solution 

after max. 1 h 

Evaluate at 450 nm 

(Referencewavelength: 650 nm) 

α-method 

Test result 


BEP ® 2000 

Menu programming 

for the 


MENU NO 

OPERATE 1 

NO 

WASHINGS 

ASPIRATE 

SOAKTIME 

DISP VOL 

CHANNEL NO 

PHOT 

OPERATE 2 

YES 

DISPENSE CONJUGATE 

WASHINGS 0 

ASPIRATE 

NO 

SOAKTIME 0 

DISP VOL 25 

CHANNEL NO 1 

PHOT 

NO 

OPERATE 3 

YES 

WASH AND DISPENSE 

CHROMOGEN 

WASHINGS 4 

ASPIRATE 

NO 

SOAKTIME 0 

DISP VOL 100 

CHANNEL NO 4 

PHOT 

NO 

OPERATE 4 

YES 

DISPENSE STOPPING SOLUTION 

WASHINGS 0 

ASPIRATE 

NO 

SOAKTIME 0 

DISP VOL 100 

CHANNEL NO 5 

PHOT 

YES 

MEAS WL 450 

REF WL 650 

BLK COR 

NO 

EVAL MODE 1 

GEN CUT 

NO 

NEG CONT 4 

MAX NEG 0.120 

MIN NEG - 

FACT NEG - 

MAX POS - 

THRESH 0.08 

CUT OFF - 

OQNE G11 C0541 (906) H/R 12


Anwendungsbereich 

Enzymimmunoassay zum qualitativen und quantitativen Nachweis von Antikörpern gegen Hepatitis 

B surface Antigen (HBsAg) in Serum und Plasma. 

Die Abarbeitung des Enzymimmunoassays erfolgt mit den ELISA Prozessoren BEP ® II, BEP ® III 

und BEP ® 2000. Der Test wurde entwickelt für die Untersuchung von Einzelproben, nicht von 

gepoolten Proben. Das Produkt darf nur für in vitro diagnostische Zwecke angewendet werden. 

Diagnostische Bedeutung 

Ebenso wie das Hepatitis B surface Antigen (HBsAg) ist auch der gegen das Oberflächenprotein 

gerichtete Antikörper Anti-HBs ein wichtiger diagnostischer Parameter einer Infektion mit dem 

Hepatitis B Virus (HBV) 1, 2 . 

Während der Inkubationszeit und der akuten Phase einer HBV-Infektion sind Antikörper gegen das 

HBsAg nicht nachweisbar. Die Immunität verleihenden Antikörper Anti-HBs erscheinen in 90 % 

aller Fälle erst in der späten Rekonvaleszenz ca. 3 bis 4 Monate nach Erkrankungsbeginn, wenn 

zirkulierendes HBsAg bereits nicht mehr nachweisbar ist 3, 4 . 

Diese Serokonversion, d.h. der Übergang von Anti-HBs-negativ zu -positiv, stellt einen recht 

zuverlässigen Parameter für eine überstandene HBV-Infektion dar, zumal auch ca. 10 % von 

akut infizierten Patienten, bei denen in der Frühphase kein HBsAg nachweisbar ist, später Anti- 

HBs-positiv werden. Daher eignet sich der Anti-HBs-Nachweis auch zur Diagnose von 

inapparent verlaufenden HBV-Infektionen 3, 4 . 

Da ein positiver Nachweis von Anti-HBs auf eine vorausgegangene Exposition mit diesem Antigen 

entweder durch eine HBV-Infektion oder in Form eines Impfstoffes hinweist, ergeben sich 

als wichtigste Anwendungen der Anti-HBs-Bestimmung die folgenden Untersuchungen: 

a) Beurteilung der Rekonvaleszenz und in gewissem Umfang auch Prognose bei HBV-infizierten Patienten 

(Verlaufskontrolle). 

b) Serologische Untersuchungen im Rahmen von Impfprogrammen (Screening und Immunisierungskontrolle). 

c) Epidemiologische Erhebungen. 

Neben dem qualitativen Anti-HBs-Nachweis hat die quantitative Ermittlung von Anti-HBs unter 

dem Gesichtspunkt der aktiven Immunisierung eine eigene Bedeutung erlangt. Gemäß einer 

Empfehlung der WHO kann von einem Infektionsschutz nach einer Schutzimpfung dann ausgegangen 

werden, wenn sich im Serum oder Plasma eine Anti-HBs-Konzentration von > 10 IU/l 

nachweisen läßt. Es werden rechtzeitige Auffrischungsimpfungen empfohlen, um sicherzustellen, 

daß dieser Grenzwert nicht unterschritten wird 5, 6, 7 . 

Bei Anti-HBs Werten < 100 IU/l nach der Grundimmunisierung ist, gemäß den Impfempfehlungen 

der Ständigen Impfkommision des Robert-Koch-Institutes (Deutschland) (STIKO, Stand Oktober 

1995), eine Auffrischimpfung innerhalb eines Jahres indiziert. 

Unterstrichen wird die Notwendigkeit einer Quantifizierung ferner durch die Tatsache, daß die 

Dauer des Impfschutzes proportional zur erreichten Anti-HBs-Konzentration nach Impfung ist. 

Prinzip der Methode 

Bei Enzygnost * Anti-HBs II handelt es sich um einen nach dem Sandwich-Prinzip aufgebauten 

Einschrittassay. Als Festphasen- und Konjugatantigen wird humanes HBsAg eingesetzt. 

Peroxidase-markiertes HBsAg bindet sich an die in der Probe enthaltenen HBs-spezifischen 

Antikörper. Diese binden sich an das an der Oberfläche der Mikrotitrationsplatte gebundene 

HBsAg (Antigen-Sandwich). 

Nach Entfernung der ungebundenen Bestandteile durch Waschen wird die gebundene Enzymaktivität 

des Konjugates bestimmt. Die enzymatische Umsetzung von Substrat und Chromogen 

(blaue Farbreaktion) wird durch Zusatz von Stopplösung POD unterbrochen (gelbe 

Farbreaktion). Die Farbintensität ist der in der Probe vorhandenen Antikörperkonzentration proportional. 

Die Quantifizierung erfolgt durch Berechnung nach der α-Methode oder durch Vergleich 

mit einer Standardkurve. 

OQNE G11 C0541 (906) H/R 13 Ausgabe Februar 2004

Reagenzien 

Inhalt der Handelspackung 


Enzygnost * Anti-HBs II 1 Testplatte 10 Testplatten 

HBsAg/POD-Konjugat (Anti-HBs II) 1 x 6 ml 10 x 6 ml 

Anti-HBs-Serum 100 1 x 1,5 ml 3 x 1,5 ml 

Anti-HBs-Serum, negativ 2 x 14 ml 5 x 14 ml 

Waschlösung POD (Konzentrat)** 1 x 100 ml 2 x 100 ml 

Puffer/Substrat TMB** 1 x 30 ml 4 x 30 ml 

Chromogen TMB** 1 x 3 ml 4 x 3 ml 

Stopplösung POD** 1 x 100 ml 2 x 100 ml 

Leerflasche für Chromogen-Gebrauchslösung 1 Stück 1 Stück 

Abklebefolien 6 Stück 24 Stück 

PE-Beutel 1 Stück 1 Stück 

Barcodewertetabelle 1 Stück 1 Stück 

Packungsbeilage 1 Stück 1 Stück 

Weitere Handelspackung: 100 x 96 

** Diese Komponenten sind auch Bestandteile der Packung Zusatz-Reagenzien für Enzygnost* 

TMB (Bestell-Nr. OUVP). 

Zusammensetzung 

Enzygnost * Anti-HBs II (Testplatte): Mit inaktiviertem HBsAg (Subtypen ad und ay), das aus 

Human-Blut isoliert wurde, beschichtete Mikrotitrationsplatte. 

HBsAg/POD-Konjugat (Anti-HBs II): inaktiviertes HBsAg, Peroxidase (POD)-konjugiert aus 

Human-Blut, Tris (ca. 100 g/l), NaCl (ca. 47 g/l) 

Konservierungsmittel: Phenol (max. 1 g/l) 

Anti-HBs-Serum 100: Anti-HBs-Humanserum (nominell 100 ± 25 IU/l), bezogen auf das WHO- 

Referenz-Präparat, Extinktionsrichtwert: ≥ 0,7. 

Konservierungsmittel: Amphotericin (ca. 5 mg/l) 

Gentamicin (ca. 100 mg/l) 

Anti-HBs-Serum, negativ: Humanserum, Extinktionsrichtwert: ≤ 0,12 

Konservierungsmittel: Amphotericin (ca. 5 mg/l) 

Gentamicin (ca. 100 mg/l) 

Waschlösung POD (Konzentrat): Tween-haltige Phosphat-Pufferlösung (90 mmol/l) 

Konservierungsmittel: Phenol (max. 1 g/l) 

Puffer/Substrat TMB: Wasserstoffperoxid (ca. 0,1 g/l) in Acetat-Pufferlösung (25 mmol/l) 

Konservierungsmittel: n-Butanol (max. 10 ml/l) 

Chromogen TMB: Tetramethylbenzidin-dihydrochlorid (5 g/l) 

Stopplösung POD: 0,5 N Schwefelsäure 

Warnungen und Vorsichtsmaßnahmen 

1. Nur zur in vitro diagnostischen Anwendung. 

2. Jede individuelle Blutspende, die zur Herstellung der Kontrollen von Enzygnost * Anti-HBs II 

vorgesehen war, wurde auf HBsAg, auf Anti-HCV, auf Anti-HIV1 und auf Anti-HIV2 untersucht. 

Für die Herstellung wurden nur Spenden mit negativem Befund verwendet. 

Unabhängig davon sollten alle aus menschlichem Blut gewonnenen Materialien wegen nie 

auszuschließender Gefährdung durch Krankheitserreger mit angemessener Sorgfalt unter 

Einhaltung der bei Biogefährdung empfohlenen Sicherheitsmaßnahmen gehandhabt werden 

8 . 

OQNE G11 C0541 (906) H/R 14

3. Das zur Herstellung der Testplatten und des POD-Konjugates verwendete HBsAg wurde aus 

HBsAg-positiven Human-Plasmen, die negativ hinsichtlich Anti-HCV, Anti-HIV1 und Anti- 

HIV2 befundet wurden, in hoher Reinheit isoliert und einem anerkannten 

Inaktivierungsverfahren unterworfen. 

4. Das Tragen von Untersuchungshandschuhen während der gesamten Testdurchführung wird 

angeraten. 

5. Für die Entsorgung fester infektiöser Materialien empfiehlt sich eine Autoklavierung von mindestens 

1 Stunde bei +121 °C. Alle abgesaugten Lösungen sind in zwei hintereinandergeschalteten 

Vorlagen zu sammeln. Die Vorlagen sollten ein Desinfektionsmittel enthalten, das 

geeignet ist, human-pathogene Viren zu inaktivieren. Die vom Hersteller angegebenen Konzentrationen 

und Einwirkungszeiten müssen beachtet werden. 

Vorbereitung der Reagenzien 

Alle Reagenzien und Proben vor Testbeginn auf +15 bis +25 °C erwärmen. Dabei die Testplatte 

nicht dem Behältnis entnehmen. 

Für die Testdurchführung nicht benötigte Riegel dem Halterahmen entnehmen und für die spätere 

Verwendung lagern (siehe Tabelle 1). 

Je Testplatte 20 ml Waschlösung POD mit destilliertem oder entionisiertem Wasser auf 400 ml 

verdünnen. 

Je Testplatte 1 ml Chromogen TMB mit 10 ml Puffer/Substrat TMB in der mitgelieferten Leerflasche 

verdünnen (Chromogen-Gebrauchslösung) und verschlossen unter Lichtschutz aufbewahren. 

Flasche nach Gebrauch sorgfältig mit destilliertem Wasser spülen. 

Wegen technisch bedingter Überfüllung ist das Überführen des Flascheninhalts von Chromogen 

TMB in die Abfüllung Puffer/Substrat TMB nicht zulässig. 

Vorverdünnung der Proben: Für die quantitative Testdurchführung sollten die Proben bei zu 

erwartenden Anti-HBs-Konzentrationen von ≥ 100 IU/l wie folgt verdünnt werden: 

Bis 1000 IU/l Verdünnung 1:10 (z.B. 20 µl Probe + 180 µl Anti-HBs-Serum, negativ). 

Bis 10.000 IU/l Verdünnung 1:100 (z.B. 20 µl Probe + 180 µl Anti-HBs-Serum, negativ; daraus 

20 µl + 180 µl Anti-HBs-Serum, negativ). 

Bis 100.000 IU/l Verdünnung1:1000 (z.B. 20 µl Probe + 180 µl Anti-HBs-Serum, negativ; daraus 

20 µl + 180 µl Anti-HBs-Serum, negativ; daraus 

20 µl + 180 µl Anti-HBs-Serum, negativ). 

Wenn die quantitative Testdurchführung mit einer Standardreihe durchgeführt wird, müssen von 

dem Anti-HBs-Serum 100 zusätzlich folgende Verdünnungen mit dem Anti-HBs-Serum, negativ 

hergestellt werden (gilt nicht für die Auswertung mit α-Methode): 

50 IU/l: Verdünnung 1:2 (z.B. 200 µl Anti-HBs-Serum 100 + 200 µl Anti-HBs-Serum, negativ) 

25 IU/l: Verdünnung 1:4 (z.B. 150 µl des 50 IU/l Serum + 150 µl Anti-HBs-Serum, negativ) 

10 IU/l: Verdünnung 1:10 (z.B. 50 µl Anti-HBs-Serum 100 + 450 µl Anti-HBs-Serum, negativ) 

5 IU/l: Verdünnung 1:20 (z.B. 150 µl des 10 IU/l Serum + 150 µl Anti-HBs-Serum, negativ) 

Haltbarkeit und Lagerungsbedingungen 

Ungeöffnet sind alle Bestandteile der Kombinationspackung Enzygnost * Anti-HBs II bei einer 

Lagertemperatur von +2 bis +8 °C bis zu den auf den Etiketten angegebenen Daten verwendbar. 

Die Haltbarkeit und Lagerbedingungen der geöffneten bzw. gebrauchsverdünnten Reagenzien 

sind der Tabelle 1 in der Anlage zu entnehmen. 

Erforderliche Geräte 

BEP ® II: Zur automatischen Durchführung der Reagenzien-Dosierung und der Waschschritte 

BEP ® III: Zur automatischen Testabarbeitung nach der Probendosierung sowie Auswertung 

BEP ® 2000: Zur vollautomatischen Testabarbeitung sowie Auswertung 

Pipetten: Kolbenhubpipetten: 25, 100 und 1000 µl 

Inkubator: Bedecktes Wasserbad (+37 ± 1 °C) oder vergleichbare Inkubationsmethoden 

Alle zur Testdurchführung eingesetzten Geräte müssen validiert sein. 

OQNE G11 C0541 (906) H/R 15

Untersuchungsmaterial 

Zur Untersuchung können Einzelproben (Human-Seren oder -EDTA/Heparin/Citrat-Plasmen) verwendet 

werden, welche nach Standard-Labortechniken entnommen wurden. Die Proben sollen 

maximal 3 Tage bei 2 - 8 °C gelagert werden. Zur längeren Lagerung sind die Proben einzufrieren. 

Testdurchführung 

Testdurchführung mit BEP ® II 

1. Ansatzschema: Benötigte Anzahl der Vertiefungen feststellen (= Anzahl der zu untersuchenden 

Proben plus 6 Vertiefungen für die Kontrollen). 

2. Proben-Dosierung: 

Qualitativer Test/Quantitativer Test (α - Methode): 

In 4 Vertiefungen (A1 bis D1) je 100 µl Anti-HBs-Serum, negativ, in eine Vertiefung (E1) 100 µl 

Anti-HBs-Serum 100, in die folgenden Vertiefungen je 100 µl Probe und am Ende der Serie 

bzw. Testplatte noch einmal 100 µl Anti-HBs-Serum 100 einpipettieren. 

Die Pipettiervorgänge müssen zügig innerhalb von 15 min pro Testplatte durchgeführt werden. 

Wichtig: Es ist unzulässig, zunächst das Anti-HBs-Serum 100 in die beiden vorgesehenen 

Positionen zu pipettieren und anschließend die Proben "dazwischenzuschieben". 

Quantitativer Test (Standardreihe): 

In 4 Vertiefungen je 100 µl Anti-HBs-Serum, negativ und anschließend in jeweils 2 Vertiefungen 

je 100 µl des Anti-HBS-Serums entsprechend 100, 50, 25, 10 und 5 IU/l pipettieren. In die 

folgenden Vertiefungen je 100 µl Probe (evtl. nach Bedarf vorverdünnt) dosieren. 

Die Konjugat-Dosierung unmittelbar nach Beendigung der Proben-Dosierung anschließen. 

3. Konjugat-Dosierung: In jede Vertiefung 25 µl des HBsAg/POD-Konjugates (Anti-HBs II) einfüllen. 

Anschließend mit Folie abkleben und die Platte unmittelbar nach Beendigung der 

Konjugat-Dosierung in den Inkubator stellen. 

4. Inkubation: 60 ± 2 min bei 37 ± 1 °C inkubieren, Waschvorgang unmittelbar anschließen. 

5. Waschen: Folie abziehen, alle Vertiefungen aussaugen und mit je ca. 0,3 ml Waschlösung 

4mal waschen. Nach Abschluß der Waschschritte die Substrat-Dosierung sofort anschließen, 

um ein Eintrocknen zu vermeiden. 

6. Substrat-Dosierung: In jede Vertiefung 100 µl der Chromogen-Gebrauchslösung einfüllen, 

Platte mit neuer Folie abkleben. 

7. Substrat-Inkubation: 30 ± 2 min bei +15 bis +25 °C lichtgeschützt inkubieren. 

8. Stoppreaktion: Die Folie entfernen. Je Vertiefung 100 µl Stopplösung POD zugeben, dabei 

den gleichen Zeittakt wie bei Punkt 6. einhalten. 

9. Messung: Innerhalb einer Stunde bei 450 nm photometrieren. Als Wellenlänge der Referenzmessung 

wird 650 nm (ggf. zwischen 615 und 690 nm) empfohlen. 

Testdurchführung mit BEP ® III 

Bei der Abarbeitung mit BEP ® III müssen die Testplatten einschließlich der Probendosierung 

(Punkt 1 und 2 der "Testduchführung BEP ® II") vorbereitet werden. Unmittelbar im Anschluss 

daran werden die Testplatten offen, d. h. nicht mit Folie abgeklebt, in den BEP ® III eingegeben. 

Dabei ist zu beachten, dass teilbestückte Testplatten mit "Wasserriegeln" auf mindestens halbe 

Testplatten (6 Testriegel) zu ergänzen sind.Die anschließende Testabarbeitung erfolgt vollautomatisch 

(siehe BEP ® III-Bedienungsanleitung). 

Die in der BEP ® III Software eingestellten Inkubationszeiten können auf Grund der technischen 

Rahmenbedingungen (Gerätetaktung) von denen der BEP ® II Prozessierung abweichen, sind 

jedoch in der Kombination BEP ® III/Enzygnost * validiert worden. 

Testdurchführung mit BEP ® 2000 

Die Probendosierung und anschließende Testabarbeitung erfolgt vollautomatisch im Gerät (siehe 

BEP ® 2000-Bedienungsanleitung). 

OQNE G11 C0541 (906) H/R 16

Testvalidierung 

Die Einzelwerte der Extinktionen für die Kontroll-Sera werden zur Berechnung der Mittelwerte 

eingesetzt, wenn: 

-0,010 ≤ E neg. ≤ 0,120 

E Anti-HBs-Serum 100 ≥ 0,7 

Von den Extinktionswerten der negativen Kontrollen kann ein außerhalb der Spezifikation liegender 

Wert vernachlässigt werden. Die Extinktionswerte des Anti-HBs-Serum 100 müssen beide 

die Spezifikation erfüllen. Werden diese Bedingungen nicht erfüllt, ist der Test zu wiederholen. 

Für den quantitativen Test gelten folgende Validierungskriterien: 

Bei Verwendung der Standardreihe: 

E neg. ≤ E Standard 5 IU/l 

Bei Verwendung der α - Methode: 

Die Einzelwerte der Extinktionen für das Anti-HBs-Serum 100 werden zur Berechnung des Mittelwertes 

eingesetzt wenn: 

untere Toleranzgrenze < E Anti-HBs-Serum 100 < obere Toleranzgrenze 

Die Werte für die untere und obere Toleranzgrenze sind in der beiliegenden Wertetabelle angegeben. 

Beide Extinktionswerte des Anti-HBs-Serum 100 müssen die Spezifikation erfüllen. 

Zusätzlich dürfen die Einzelwerte maximal 20 % vom Mittelwert dieser beiden Bestimmungen 

abweichen. 

Werden diese Bedingungen nicht erfüllt, ist der Test nur qualitativ auswertbar. 

Testauswertung 

Die Auswertungen erfolgen mit BEP ® 2000 und BEP ® III automatisch. Bitte dazu die Bedienungsanleitungen 

heranziehen. Die nachfolgenden Kapitel sind bei Auswertung ohne Softwareunterstützung 

zu beachten. 

Qualitativer Test: 

Aus den Extinktionswerten der negativen Kontrollen wird der Mittelwert gebildet. 

Zur Grenzwertberechnung wird zum Extinktionsmittelwert der negativen Kontrollen ein Wert von 

0,08 addiert: – E neg. + 0,08 = Grenzwert (cut off) 

Nach den Kriterien des Tests werden die Untersuchungsproben wie folgt klassifiziert: 

1. E Probe < cut off = Anti-HBs-negativ 

2. E Probe ≥ cut off = Anti-HBs-positiv 

Quantitativer Test (α - Methode): 

Für jeden einzelnen Testplattenansatz wird ein Korrekturfaktor ermittelt, mit dem der gemessene 

Extinktionswert jeder Probe korrigiert wird (Meßwertkorrektur). Die korrigierten Meßwerte werden 

anschließend zur Berechnung der Antikörperaktivität eingesetzt (Ergebnisberechnung). 

Meßwertkorrektur 

Der Korrekturfaktor wird nach folgender Formel ermittelt: 

Nominalwert 

Korrekturfaktor = ––––––––––––––––––––––––– 

Mittelwert Anti-HBs-Serum 100 

Der Nominalwert ist in der beiliegenden Wertetabelle angegeben. Die Extinktionswerte der 

Untersuchungsproben werden mit dem Korrekturfaktor multipliziert. Die erhaltenen korrigierten 

Meßwerte werden dann zur Ergebnisberechnung eingesetzt. 

OQNE G11 C0541 (906) H/R 17

Bei mehreren Testplatten ist der Korrekturfaktor für jede Platte neu zu ermitteln und für die 

entsprechende Korrekturrechnung einzusetzen. 

Ergebnisberechnung 

Die korrigierten Meßwerte der Untersuchungsproben werden zur Berechnung der Antikörperaktivität 

in die nachfolgende Formel eingesetzt (α - Methode): 

log 10 mIU/l = α . E β 

Die chargenabhängigen Konstanten α und β sind hierfür der beigepackten Wertetabelle zu entnehmen. 

Die Angabe der Antikörperaktivität in „IU/l“ bezieht sich auf das internationale HBV- 

Referenzserum der WHO. 

Achtung: Zur Berechnung werden nicht eingesetzt: 

- Meßwerte korrigiert < cut off 

- Meßwerte unkorrigiert > 2,5 

Rechenbeispiel 

Rechenwert für α 4,8239 

Rechenwert für β 0,1054 

korrigierter Meßwert einer Untersuchungsprobe 0,950 

log 10 mIU/l (nach obiger Formel) 4,7979 (siehe Anm. 1) 

davon der Numerus (in mIU/l) 62 790 (siehe Anm. 2) 

bzw. die Antikörperaktivität (IU/l) 62,79 (siehe Anm. 3) 

Anm. 1:Taschenrechnereingaben: 0,950 Taste x y , Eingabe 0,1054, Taste =, Taste x, Eingabe 

4,8239, Taste = 

Anm. 2:nach der vorstehend ermittelten Zahl dann entweder Taste 10 x oder Tasten INV und log 

betätigen. 

Anm. 3:zur Umrechnung in die Einheit IU/l muß die vorstehende Zahl durch 1 000 geteilt werden. 

Wurde die Untersuchungsprobe zur Bewertung vorverdünnt (z. B. 1:11), so ist die errechnete 

Antikörperaktivität (nicht das Meßsignal) mit 11 zu multiplizieren. 

Quantitativer Test (Standardreihe): 

Zur quantitativen Auswertung werden die Extinktionsmittelwerte aus den Doppelbestimmungen 

für die Standardreihe mit 5, 10, 25, 50 und 100 IU/l gebildet, und auf doppellogarithmischem 

Papier wird eine Bezugskurve erstellt. Abszisse: Anti-HBs Konzentration 5 bis 100 IU/l. Ordinate: 

Extinktion 0,05 bis 2,0. Aus der Bezugskurve werden anhand der einzelnen Extinktionen die 

Anti-HBs Konzentrationen der Proben abgelesen. 

Wurden die Proben verdünnt eingesetzt, so muß die auf der Bezugskurve abgelesene Konzentration 

mit dem Verdünnungsfaktor multipliziert werden. 

Einschränkungen der Testdurchführung 

1. Antikoagulantien wie Heparin, EDTA und Citrat beeinflussen das Testergebnis nicht. 

2. Lipämische, rheumafaktorhaltige, hämolytische oder ikterische Proben führen zu keiner 

Testbeeinträchtigung. 

3. Mit Proben von Schwangeren wurde keine Beeinflussung des Testergebnisses beobachtet. 

4. Proben mit folgenden potentiell störenden Substanzen wurden mit dem Test überprüft: HBs- 

Antigen, ANA sowie Antikörper gegen HCV, HAV, HBC, HBe, EBV und CMV. Mit den eingesetzten 

Proben wurde keine Beeinflussung des Testergebnisses beobachtet. 

5. Bei hitzebehandelten Proben (30 min, 56 °C) wurden keine Störungen beobachtet. 

6. Ungenügend geronnene Seren, natriumazidhaltiges Probenmaterial und mikrobiell kontaminierte 

Untersuchungsproben sollten nicht eingesetzt werden. Eventuell vorhandene partikuläre 

Komponenten (z. B. Fibrin-Gerinnsel) sollten vor der Testdurchführung entfernt werden. 

7. Bei aufgetauten Proben ist auf eine gute Homogenisierung des Materials zu achten. 

OQNE G11 C0541 (906) H/R 18

8. Die Reagenzien (ausgenommen Waschlösung POD, Stopplösung POD und die aus den 

chargengebundenen Reagenzien Chromogen TMB und Puffer/Substrat TMB hergestellte 

Chromogen-Gebrauchslösung) sind nur chargengebunden zu verwenden, d.h. nur in der 

Kombination der einzelnen 6-ziffrigen Chargen-Bezeichnungen, die auf der Packung aufgedruckt 

bzw. der separat beigepackten Barcode-Tabelle zu entnehmen sind. 

9. Puffer/Substrat TMB, Chromogen-Gebrauchslösung und Stopplösung POD dürfen nicht in 

Kontakt mit Schwermetallionen oder oxidierenden Substanzen kommen (keine Pipetten mit 

flüssigkeitsführenden Metallteilen verwenden). Die Substratreaktionen nicht in der Nähe von 

Hypochlorit-haltigen Desinfektionsmitteln durchführen. Eine spontane Blaufärbung der 

Chromogen-Gebrauchslösung vor der Übertragung in die Testplatte deutet auf Kontamination 

hin; eine frische Lösung ist in einem sauberen Gefäß anzusetzen. Hautkontakt mit den 

vorgenannten Lösungen ist zu vermeiden. 

10. Die Kontrollsera sind unter Verwendung nativer Humansera hergestellt. Daher können Trübungen 

auftreten, die das Testergebnis jedoch nicht beeinflussen. 

11. Die Testplatte soll während der Inkubation ruhig liegen (z.B. auf fixierter Schwimmhilfe oder 

im nicht zirkulierenden Wasserbad); die Kavitäten sind dabei in Kontakt mit dem temperierten 

Wasser. Werden Stabilisatoren zur Verhinderung der Verkeimung des Wassers verwendet, 

so ist sorgfältig darauf zu achten, daß weder die Testplattenoberfläche noch die Näpfchen 

mit diesen Lösungen in Kontakt kommen, da dadurch unspezifische Reaktionen hervorgerufen 

werden könnten. 

12. Bei stark reaktiven Proben kann bei der Stoppreaktion der Farbstoff ausfallen. Die photometrische 

Auswertung wird dadurch nicht beeinflußt. 

13. Dade Behring hat den Einsatz dieser Reagenzien auf verschiedenen Analysengeräten auf 

optimale Produktleistung und Einhaltung der Produktspezifikationen überprüft. Vom Benutzer 

vorgenommene Änderungen werden von Dade Behring nicht unterstützt, da sie die Leistung 

des Systems und die Testergebnisse beeinflussen können. Es liegt in der Verantwortung 

des Benutzers, Änderungen an diesen Anleitungen oder die Verwendung dieser Reagenzien 

auf anderen als in den Applikationsvorschriften von Dade Behring oder diesen Gebrauchsanweisungen 

genannten Analysengeräten zu validieren. 

14. Resultate dieses Tests sollten stets in Verbindung mit der Vorgeschichte des Patienten, dem 

klinischen Bild und anderen Untersuchungsergebnissen interpretiert werden. 

Leistungsmerkmale des Tests 

Sensitivität und Spezifität 

Die Ergebnisse zur Prüfung der Sensitivität und Spezifität sind in den Tabellen 2 + 3 (im Anhang) 

zusammengefaßt. 

Bei der Ermittlung der diagnostischen Sensitivität wurden insgesamt 515 Anti-HBs-positive Proben 

untersucht und eine Sensitivität von 100 % ermittelt. Die Reaktivität des Testes bei 

Serokonversionsproben/Impfverläufen wurde anhand von 41 Verläufen untersucht. Dabei zeigte 

sich, daß Enzygnost * Anti-HBs II eine Sensitivität bezüglich der Erkennung von Serokonversionen/ 

Impfverläufen aufweist, die der Empfindlichkeit vergleichbarer Teste entspricht. 

Die analytische Sensitivität wurde bei quantitativer Auswertung (Standardkurve) am WHO-Referenz-Präparat 

mit < 8 IU/l ermittelt. 

Bei der Ermittlung der Spezifität wurden insgesamt 4736 Anti-HBs-negative Blutspendeproben 

untersucht und eine Spezifität von 99,5 bis 99,7 % ermittelt. Bedingt durch das Untersuchungskollektiv, 

die Testdurchführung u.a. sind abweichende Werte möglich. 

Reproduzierbarkeit 

Die Ergebnisse zur Intra/Inter-assay-Reproduzierbarkeit sind in der Tabelle 4 (im Anhang) zusammengefaßt. 

Es handelt sich hierbei um beispielhaft ermittelte Daten. Abhängig von der Testdurchführung 

u.a. sind durchaus abweichende Werte möglich. 

* Enzygnost ist eine eingetragene Marke der Dade Behring Marburg GmbH in Deutschland und 

anderen Ländern. 

BEP ist eine eingetragene Marke der Dade Behring Marburg GmbH in den USA, Deutschland 

und anderen Ländern. 


0197 




OQNE G11 C0541 (906) H/R 19

Tab. 1 Haltbarkeit und Lagerungsbedingungen 

Material/Reagenz Zustand Lagerung Stabilität • 

Enzygnost * Anti-HBs II (Testplatte) nach Öffnen +2 bis +8 °C 4 Wochen 

im Beutel mit 

Trockenkapseln 

HBsAg/POD-Konjugat (Anti-HBsII) nach Öffnen +2 bis +8 °C 4 Wochen 

Anti-HBs-Serum 100 nach Öffnen +2 bis +8 °C 4 Wochen 

Anti-HBs-Serum, negativ < -20 °C 3 Monate 

Chromogen TMB nach Öffnen +2 bis +8 °C bis Verfallsdatum 

Puffer/Substrat TMB nach Öffnen +2 bis +8 °C bis Verfallsdatum 

Chromogen-Gebrauchslösung verdünnt +2 bis +8 °C 5 Tage 

1 + 10 +15 bis +25 °C 8 Stunden 

geschlossenes 

Gefäß 

lichtgeschützt 

Waschlösung POD (Konzentrat) nach Öffnen +2 bis +8 °C bis Verfallsdatum 

verdünnt 1:20 +2 bis +8 °C 1 Woche 

verdünnt 1:20 +18 bis +25 °C 1 Tag 

Stopplösung POD nach Öffnen +2 bis +8 °C bis Verfallsdatum 

• in keinem Fall länger als bis zum Verfallsdatum 

Tab. 2 Sensitivität 

Bei den Untersuchungen zur Sensitivität wurden anhand von unterschiedlichen Probenkollektiven 

folgende Daten ermittelt: 


Probenkollektiv Probenanzahl reaktiv 

Anti-HBs positiv (Deutschland) 106 106 

Anti-HBs positiv (Amerika) 52 52 

Verlaufskontrollproben 25 25 

Anti-HBs positiv 100 100 

verschiedene Stadien einer HBV-Infektion 41 41 

HBV-Geimfte 111 111 

Anti-HBs-positiv 80 80 

Impfverläufe 32 Verläufe Sensitivität entspricht 

Serokonversion 9 Verläufe der Empfindlichkeit 

vergleichbarer Teste 

Tab. 3 Spezifität 

Bei den Untersuchungen zur Spezifität wurden anhand von Proben unterschiedlicher Blutbanken 

folgende Daten ermittelt: 


Probenkollektiv Probenanzahl reaktiv 

normal negative Seren 2296 11 

normal negative Plasmen 646 2 

normal negative Seren 1508 5 

normal negative Plasmen 286 1 

OQNE G11 C0541 (906) H/R 20

Tab. 4 Reproduzierbarkeit 

Bei den Untersuchungen zur Intra-assay-Reproduzierbarkeit wurden an zwei unabhängigen 

Zentren (K, E) die Proben an 5 Tagen in jeweils 8fach-Bestimmung getestet. Die VK-Berechnung 

erfolgte nach dem Varianzkomponentenmodell. 


Probe Ratio-Mittelwert % VK 

(K) P1 0,3 13,0 

P2 1,0 5,0 

P3 3,1 2,6 

P4 11,3 2,2 

(E) F1 0,3 9,1 

F2 1,0 4,7 

F3 4,0 3,0 

F4 9,1 4,8 

F5 14,5 5,0 

Bei den Untersuchungen zur Inter-assay-Reproduzierbarkeit wurden an zwei unabhängigen 

Zentren (K, E) die Proben an 5 Tagen in jeweils 8fach-Bestimmung getestet. Die VK-Berechnung 

erfolgte nach dem Varianzkomponentenmodell. 


Probe Ratio-Mittelwert % VK 

(K) P1 0,3 8,3 

P2 1,0 4,1 

P3 3,1 2,3 

P4 11,3 3,6 

(E) F1 0,3 12,9 

F2 1,0 4,0 

F3 4,0 2,2 

F4 9,1 2,2 

F5 14,5 2,5 

Ratio = Extinktion/Grenzwert 

OQNE G11 C0541 (906) H/R 21

Tab. 5 Testdurchführung und -programmierung 

Testdurchführung 



25 µl Konjugat 


(37 ± 1 °C) 

4 x Waschen: BEP ® II 

Vorbereitung der Reagenzien 

4 x 100 µl Kontroll-Serum, negativ 

1 x 100 µl Kontroll-Serum, positiv 

je 100 µl unverdünnte Probe 

1 x 100 µl Kontroll-Serum, positiv 


teilbestückte Platten mit 

„Wasserriegeln“ auf halbe 

Platten ergänzen 

100 µl Chromogen- automatische 

Gebrauchslösung 

Testabarbeitung 


+15 °C bis +25 °C 

lichtgeschützt 

100 µl Stopplösung 

nach maximal 1 h 

Auswertung 450 nm 

(Referenzwellenlänge: 650 nm) 

α-Methode 

Testergebnis 


BEP ® 2000 

Menüprogrammierung 

für den 


MENU NO 

OPERATE 1 

NO 

WASHINGS 

ASPIRATE 

SOAKTIME 

DISP VOL 

CHANNEL NO 

PHOT 

OPERATE 2 

YES 

DOSIERUNG KONJUGAT 

WASHINGS 0 

ASPIRATE 

NO 

SOAKTIME 0 

DISP VOL 25 

CHANNEL NO 1 

PHOT 

NO 

OPERATE 3 

YES 

WASCHEN UND DOSIERUNG 

CHROMOGEN 

WASHINGS 4 

ASPIRATE 

NO 

SOAKTIME 0 

DISP VOL 100 

CHANNEL NO 4 

PHOT 

NO 

OPERATE 4 

YES 

DOSIERUNG STOPPLÖSUNG 

WASHINGS 0 

ASPIRATE 

NO 

SOAKTIME 0 

DISP VOL 100 

CHANNEL NO 5 

PHOT 

YES 

MEAS WL 450 

REF WL 650 

BLK COR 

NO 

EVAL MODE 1 

GEN CUT 

NO 

NEG CONT 4 

MAX NEG 0.120 

MIN NEG - 

FACT NEG - 

MAX POS - 

THRESH 0.08 

CUT OFF - 

OQNE G11 C0541 (906) H/R 22


Domaine d’utilisation 

Test immunoenzymatique qui permet la mise en évidence qualitative et quantitative des 

anticorps anti-antigène de surface de l’hépatite B (AgHBs) dans le sérum ou le plasma. 

Le test immunoenzymatique s’effectue à l’aide des ELISA Processors BEP ® II, BEP ® III et BEP ® 

2000. Il a été mis au point pour l’analyse d’échantillons individuels et non pas d’échantillons 

poolés. Les réactifs ne peuvent être utilisés qu’à des fins de diagnostic in vitro. 

Intérêt diagnostique 

Tout comme l’antigène de surface de l’hépatite B (AgHBs), l’anticorps anti-HBs dirigé contre la 

protéine de surface constitue également un marqueur biologique important de l’infection par le 

virus de l’hépatite B (HBV) 1, 2 . 

Pendant le temps d’incubation et la phase aiguë d’une infection à HBV, les anticorps anti-HBs ne 

peuvent être révélés. Les anticorps anti-HBs qui confèrent l’immunité n’apparaissent dans 90% 

des cas que dans la période de convalescence tardive, env. 3 à 4 mois après le début de la 

maladie, alors que l’AgHBs circulant ne peut déjà plus être mis en évidence 3, 4 . 

Cette séroconversion, c’est-à-dire le passage d’un état anti-HBs-négatif à un état anti-HBspositif, 

constitue un paramètre très fiable pour confirmer la guérison d’une infection à HBV, et ce 

d’autant plus qu’env. 10% des patients infectés de façon aiguë et chez qui l’AgHBs n’a pu être 

mis en évidence dans la phase précoce, deviennent plus tard anti-HBs-positifs. Aussi la mise en 

évidence d’anti-HBs permet-elle aussi le diagnostic d’infections à HBV asymptomatiques 3, 4 . 

Dans la mesure où la mise en évidence d’anti-HBs indique un contact ancien avec cet antigène, 

soit par une infection à HBV soit par un vaccin, voici les principales indications d’un dosage 

d’anti-HBs : 

a) évaluation de la convalescence et, dans certains cas, pronostic pour les patients infectés par 

l’HBV (contrôle d’évolution), 

b) études sérologiques dans le cadre de programmes de vaccination (dépistage et contrôle 

d’immunisation), 

c) sondages épidémiologiques. 

Outre la mise en évidence qualitative de l’anti-HBs, son dosage quantitatif a acquis un intérêt 

particulier pour l’immunisation active. Conformément à une recommandation de l’OMS, une personne 

vaccinée contre l’hépatite peut être considérée comme protégée d’une infection si son taux 

sérique ou plasmatique d’anti-HBs est > 10 UI/ml. Il est recommandé d’effectuer des injections de 

rappel suffisamment tôt pour ne pas passer en dessous de cette valeur-seuil (10 UI/l) 5, 6, 7 . 

Les patients dont les valeurs d’anti-HBs sont trouvées < 100 UI/l après l’immunisation de base 

doivent subir une injection de rappel dans l’année qui suit (recommandations de la Commission 

permanente de Vaccination de l’Institut Paul-Ehrlich, Allemagne, Octobre 1995). 

La nécessité d’une quantification est également renforcée par le fait que la durée de la 

protection est proportionnelle à la concentration d’anti-HBs mesurée après la vaccination. 

Principe de la méthode 

L’Enzygnost * Anti-HBs II est un test en une étape basé sur le principe sandwich. L’antigène de la 

phase solide et l’antigène du conjugué sont de l’AgHBs humain. 

L’AgHBs marqué à la peroxydase se lie aux anticorps anti-HBs-spécifiques présents dans 

l’échantillon. Ceux-ci se lient à l’AgHBs fixé à la surface de la plaque de microtitration (antigène 

sandwich). 

Après élimination par lavage des éléments non liés, on mesure l’activité enzymatique liée du 

conjugué. La transformation enzymatique du substrat et du chromogène (réaction colorée bleue) 

est interrompue par l’addition de la Solution d’arrêt POD (coloration jaune). L’intensité de la 

coloration est proportionnelle à la concentration d’anticorps dans l’échantillon. La quantification 

se fait par un calcul selon l’α-méthode ou par comparaison avec une courbe d’étalonnage. 

OQNE G11 C0541 (906) H/R 23 Edition Février 2004

Réactifs 

Contenu du coffret 


Enzygnost * Anti-HBs II 1 plaque-test 10 plaques-test 

Conjugué AgHBs/POD (Anti-HBs II) 1 x 6 ml 10 x 6 ml 

Sérum Anti-HBs 100 1 x 1,5 ml 3 x 1,5 ml 

Sérum Anti-HBs négatif 2 x 14 ml 5 x 14 ml 

Solution de lavage POD (concentrée)** 1 x 100 ml 2 x 100 ml 

Tampon/substrat TMB** 1 x 30 ml 4 x 30 ml 

Chromogène TMB** 1 x 3 ml 4 x 3 ml 

Solution d’arrêt POD** 1 x 100 ml 2 x 100 ml 

Flacon vide pour solution d’emploi du chromogène 1 pièce 1 pièce 

Feuilles adhésives 6 pièce 24 pièce 

Sachet PE 1 pièce 1 pièce 

Tableau de codes à barres 1 pièce 1 pièce 

Fiche technique 1 pièce 1 pièce 

Autre conditionnement : 100 x 96 

** Ces éléments font également partie du Coffrert de réactifs complémentaries pour Enzygnost* TMB 

(code OUVP). 

Composition 

Enzygnost * Anti-HBs II (plaque-test) : plaque de microtitration recouverte d’AgHBs inactivé 

(sous-types ad et ay), isolé à partir de sang humain. 

Conjugué AgHBs/POD (Anti-HBs II) : 

Agent de conservation : 

Sérum Anti-HBs 100 : 

Agents de conservation : 

AgHBs inactivé, conjugué à la peroxydase (POD), 

obtenu à partir de sang humain, Tris (env. 100 g/l), 

NaCl (env. 47 g/l). 

phénol (max. 1 g/l) 

antisérum humain anti-HBs (contenant nominalement 

100 ± 25 UI/l), par rapport à la préparation de 

référence de l’OMS, valeur de D.O. indicative : ≥ 0,7. 

amphotéricine (env. 5 mg/l) 

gentamycine (env. 100 mg/l) 

Sérum Anti-HBs négatif : sérum humain, valeur de D.O. indicative : ≤ 0,12 

Agents de conservation : 

amphotéricine (env. 5 mg/l) 

gentamycine (env. 100 mg/l) 

Solution de lavage POD (concentrée) : solution tampon phosphate contenant du Tween (90 

mmol/l) 


phénol (max. 1 g/l) 

Tampon/substrat TMB : 

peroxyde d’hydrogène (env. 0,1 g/l) en solution 

tampon acétate (25 mmol/l) 


n-butanol (env. 10 ml/l) 

Chromogène TMB : 

tétraméthylbenzidine-dihydrochlorure (5 g/l) 

Solution d’arrêt POD : 

acide sulfurique 0,5 N 

OQNE G11 C0541 (906) H/R 24

Mises en garde et précautions d’emploi 

1. Ne doit être employé que pour un usage in vitro 

2. Tout don de sang prévu pour la préparation des contrôles de l’Enzygnost * Anti-HBs II est 

soumis à une recherche de l'AgHBs, d’anti-VHC, d’anti-VIH1 et d’anti-VIH2. Seuls les dons 

trouvés négatifs sont utilisés. 

Indépendamment de cela, toute préparation obtenue à partir de sang humain doit être 

manipulée avec les précautions nécessaires en cas de risque biologique, dans la mesure où 

on ne peut exclure totalement tout risque d’infection 8 . 

3. L'AgHBs hautement purifié utilisé pour la préparation des plaques-tests et du Conjugué POD 

est isolé à partir de plasmas humains positifs en AgHBs, et trouvés négatifs en anti-VHC, anti- 

VIH1 et anti-VIH2. Il est ensuite inactivé selon un procédé reconnu. 

4. Il est recommandé de porter des gants de protection pendant toute la réalisation du test. 

5. Pour décontaminer le matériel de laboratoire infecté, l’autoclaver pendant au moins 1 heure à 

+121°C. Toutes les solutions aspirées doivent être récoltées dans deux récipients reliés l’un à 

l’autre et contenant chacun un désinfectant spécialement conçu pour inactiver les virus 

pathogènes pour l’homme. Respecter les concentrations et temps d’incubation indiqués par 

le fabricant. 

Préparation des réactifs 

Porter tous les réactifs et échantillons à +15/+25°C avant le début du test, sans sortir la plaquetest 

de son emballage. 

Sortir du cadre les barrettes non utilisées dans le test, et les conserver pour un usage ultérieur 

(cf. Tabl. 1). 

Pour une plaque, diluer 20 ml de solution de lavage POD avec de l’eau distillée ou désionisée 

en complétant à 400 ml. 

Pour une plaque, diluer 1 ml de Chromogène TMB avec 10 ml de Tampon/substrat TMB dans 

le flacon plastique vide inclus dans le coffret (solution d’emploi du chromogène) et la conserver 

dans le flacon fermé à l’abri de la lumière. Après emploi, bien rincer le flacon avec de l’eau 

distillée. 

Pour des raisons de capacité de flacon, il est impossible de verser la totalité du contenu d’un 

flacon de Chromogène TMB dans un flacon de Tampon/substrat TMB. 

Prédilution des échantillons : pour une réalisation quantitative du test, et si on s’attend à des 

concentrations d’anti-HBs ≥ 100 UI/l, diluer les échantillons comme suit : 

Jusqu’à 1 000 UI/l : dilution au 1/10 (par ex. 20 µl d’échantillon + 180 µl de Sérum Anti-HBs négatif). 

Jusqu’à 10 000 UI/l : dilution au 1/100 (par ex. 20 µl d’échantillon + 180 µl de Sérum Anti-HBs négatif; 

puis 20 µl de cette dilution + 180 µl de Sérum Anti-HBs négatif). 

Jusqu’à 100 000 UI/l : dilution au 1/1000 (par ex. 20 µl d’échantillon + 180 µl de Sérum Anti-HBs négatif; 

puis 20 µl de cette dilution + 180 µl de Sérum Anti-HBs négatif; 

puis 20 µl de cette dilution + 180 µl de Sérum Anti-HBs négatif). 

Si la réalisation quantitative du test est faite à partir d’une série standard, préparer les dilutions 

complémentaires suivantes du Sérum Anti-HBs 100 à l’aide du Sérum anti-HBs négatif (ne pas 

le faire pour une exploitation selon l’α-méthode) : 

50 UI/l: dilution au 1/2 (par ex. 200 µl de Sérum anti-HBs 100 + 200 µl de Sérum anti-HBs négatif) 

25 UI/l: dilution au 1/4 (par ex. 150 µl des 50 UI/l du Sérum + 150 µl de Sérum anti-HBs négatif) 

10 UI/l: dilution au 1/10 (par ex. 50 µl de Sérum anti-HBs 100 + 450 µl de Sérum anti-HBs négatif) 

5 UI/l: dilution au 1/20 (par ex. 150 µl des 10 UI/l du Sérum + 150 µl de Sérum anti-HBs négatif) 

Stabilités et conditions de conservation 

Tous les éléments du coffret Enzygnost * Anti-HBs II conservés à +2/+8°C dans leur flacon ou 

sachet d’origine non ouvert peuvent être utilisés jusqu’à la date indiquée sur l’étiquette. 

Pour les stabilités et conditions de conservation des réactifs ouverts ou dilués à la dilution 

d’emploi, se reporter au Tableau 1 en annexe. 

OQNE G11 C0541 (906) H/R 25

Matériel nécessaire 

BEP ® II : pour la distribution automatique des réactifs et l’automatisation des étapes de lavage 

BEP ® III : pour l’automatisation du test après la distribution des échantillons et de l’exploitation 

des résultats 

BEP ® 2000 : pour l’entière automatisation du test et de l’exploitation des résultats 

Pipettes : pipettes à embout de 25, 100 et 1000 µl. 

Incubateur : bain-marie couvert (+37 ± 1°C) ou méthode d’incubation équivalente 

Tout le matériel utilisé pour la réalisation du test doit être validé. 

Echantillons à tester 

Utiliser des échantillons (sérums humains ou plasmas citratés, héparinés ou prélevés sur EDTA) 

obtenus selon les techniques standard des laboratoires. Les échantillons peuvent être 

conservés 3 jours maximum à +2/+8°C. Pour une conservation plus longue, les congeler. 

Réalisation du test 

Réalisation du test sur le BEP ® II 

1. Schéma de distribution : déterminer le nombre de cupules nécessaires (= nombre 

d’échantillons à tester, plus 6 cupules pour les contrôles). 

2. Distribution des contrôles et échantillons : 

Test qualitatif/Test quantitatif (α - méthode) : 

Distribuer dans 4 cupules (A1 à D1) 100 µl de Sérum Anti-HBs négatif, dans 1 cupule (E1) 

100 µl de Sérum Anti-HBs 100, dans les cupules suivantes 100 µl de chacun des échantillons, 

puis en fin de série ou en fin de plaque de nouveau 100 µl de Sérum Anti-HBs 100. 

Les pipetages doivent être enchaînés, et ne pas durer plus de 15 min par plaque. 

Important : il n’est pas possible de distribuer d’abord le Sérum Anti-HBs 100 dans les 2 

cupules prévues, puis les échantillons entre celles-ci. 

Test quantitatif (chaque concentration du standard) : 

distribuer 100 µl de Sérum anti-HBs négatif dans 4 cupules, 100 µl de chaque dilution du 

sérum correspondant à 100, 50, 25, 10 et 5 UI/l dans 2 cupules, puis 100 µl de chacun des 

échantillons (éventuellement prédilués) dans les cupules suivantes. 

Enchaîner la distribution du conjugué immédiatement après celle des échantillons. 

3. Distribution du conjugué : distribuer dans chaque cupule 25 µl de Conjugué AgHBs/POD 

(Anti-HBs II). 

Couvrir ensuite d’une feuille adhésive et placer la plaque dans l’incubateur immédiatement 

après la distribution du conjugué. 

4. Incubation : laisser incuber 60 ± 2 min à +37 ±1°C, et enchaîner immédiatement le 

processus de lavage. 

5. Lavage : retirer la feuille adhésive, aspirer le contenu de toutes les cupules, et distribuer dans 

chacune d’elles env. 0,3 ml de Solution de lavage. Laver 4 fois. Dès la fin du processus de 

lavage, distribuer immédiatement le substrat afin d’éviter tout dessèchement. 

6. Distribution du substrat : ajouter dans chaque cupule 100 µl de la solution d’emploi du 

chromogène, et couvrir d’une nouvelle feuille adhésive. 

7. Incubation du substrat : laisser incuber 30 ± 2 minutes à +15/+25°C à l’abri de la lumière. 

8. Arrêt de la réaction : retirer la feuille adhésive et ajouter dans chaque cupule 100 µl de 

Solution d’arrêt POD en respectant le même rythme qu’en 6. 

9. Mesure : faire une mesure photométrique dans l’heure qui suit à 450 nm. La longueur d’onde 

de référence doit être de 650 nm (comprise entre 615 et 690 nm). 

OQNE G11 C0541 (906) H/R 26

Réalisation du test sur le BEP ® III 

Pour une utilisation sur le BEP ® III, les plaques-tests doivent être préparées jusqu’y compris la 

distribution des échantillons (points 1 et 2 du paragraphe « Réalisation du test sur le BEP ® II »). 

Immédiatement après cette étape, placer la plaque ouverte, c’est-à-dire non recouverte d’une 

feuille adhésive, dans le BEP ® III. Si la plaque n’est pas totalement utilisée, la compléter au 

moins pour moitié (6 barrettes) avec des barrettes remplies d’eau. La suite du test est ensuite 

effectuée entièrement automatiquement (cf. Manuel d’utilisation du BEP ® III). 

Les temps d’incubation prévus dans le logiciel du BEP ® III peuvent, du fait de conditions 

techniques (cadence de l’appareil), diverger par rapport à ceux du BEP ® II. Ils ont toutefois été 

validés dans la combinaison BEP ® III/Enzygnost * . 

Réalisation du test sur le BEP ® 2000 

La distribution des échantillons ainsi que toutes les étapes suivantes sont effectuées entièrement 

automatiquement par l’appareil (cf. Manuel d’utilisation du BEP ® 2000). 

Validation du test 

Calculer les valeurs moyennes des sérums de contrôle à partir des différentes valeurs mesurées si : 

-0,010 ≤ D.O. nég. ≤ 0,120 

D.O. Sérum Anti-HBs 100 ≥ 0,7 

Pour le contrôle négatif, une valeur sortant du domaine indiqué peut être négligée. 

Pour le Sérum Anti-HBs 100, les deux valeurs obtenues doivent se trouver dans le domaine 

indiqué. 

Si ces critères ne sont pas remplis, le test doit être recommencé. 

Pour le test quantitatif, les critères de validation sont les suivants : 

Avec une série standard : 

D.O. nég. ≤ D.O. standard 5 UI/l 

Avec l'α - méthode : 

les valeurs de densité optique obtenues pour le Sérum Anti-HBs 100 peuvent être utilisées pour le 

calcul de la valeur moyenne si : 

limite inférieure < D.O. Sérum Anti-HBs 100 < limite supérieure 

Les valeurs des limites inférieure et supérieure sont indiquées dans le tableau des valeurs ci-joint. 

Chacune des deux valeurs de densité optique du Sérum Anti-HBs 100 doivent répondre au critère. 

De plus, chacune des valeurs ne peut varier de plus 20% par rapport à la valeur moyenne des 

deux dosages. 

Si ces conditions ne sont pas remplies, seule une exploitation qualitative du test est possible. 

Exploitation du test 

Sur le BEP ® 2000 et le BEP ® III, le calcul des résultats se fait automatiquement. Suivre le 

déroulement du manuel d’utilisation. Le protocole indiqué ci-après permet l’exploitation des 

résultats sans aide de logiciel. 

Test qualitatif : 

Calculer la valeur moyenne des densités optiques du contrôle négatif. 

Pour obtenir la valeur-seuil, ajouter 0,08 à la valeur moyenne du contrôle négatif : 

––– 

D.O. nég. + 0,08 = valeur-seuil (cut off) 

Selon les critères du test, les échantillons sont classés comme suit : 

1. D.O. échantillon < cut off = anti-HBs-négatif 

2. D.O. échantillon ≥ cut off = anti-HBs-positif 

OQNE G11 C0541 (906) H/R 27

Test quantitatif (α - méthode): 

Déterminer pour chaque plaque un facteur de correction qui permettra de corriger les valeurs 

obtenues pour chacun des échantillons (correction de la valeur mesurée). Les valeurs corrigées 

sont ensuite utilisées pour le calcul de l’activité en anticorps (calcul du résultat). 

Correction de la valeur mesurée 

Le facteur de correction est déterminé selon la formule suivante : 

valeur nominale 

facteur de correction = –––––––––––––––––––––––––––––––– 

valeur moyenne du Sérum Anti-HBs 100 

La valeur nominale est indiquée dans le tableau des valeurs joint à chaque coffret. Multiplier les 

densités optiques des échantillons par le facteur de correction. Utiliser ensuite les valeurs 

corrigées ainsi obtenues pour le calcul du résultat. 

Si on utilise plusieurs plaques, déterminer un facteur de correction pour chaque plaque, et 

l’utiliser pour le calcul de la correction. 

Calcul du résultat 

Pour le calcul de l’activité en anticorps, utiliser la formule suivante en prenant les valeurs 

mesurées corrigées des échantillons (α-méthode) : 

log 10 mUI/l = α . D.O. β 

Les constantes α et β, qui varient selon les lots, sont indiquées dans le tableau des valeurs cijoint. 

L’activité en anticorps, exprimée en «UI/l», se réfère à l'immunoglobuline anti-HBs de 

référence internationale de l’OMS. 

Attention : pour le calcul, ne pas utiliser : 

- les valeurs mesurées corrigées < cut off 

- les valeurs mesurées non corrigées > 2,5 

Exemple de calcul 

valeur de calcul pour α 4,8239 

valeur de calcul pour β 0,1054 

valeur mesurée corrigée d’un échantillon 0,950 

log 10 mUI/l (selon formule ci-dessus) 4,7979 (voir note 1) 

soit la valeur (en mUI/l) 62 790 (voir note 2) 

ou l’activité en anticorps (UI/l) 62,79 (voir note 3) 

note 1: données à entrer sur la calculette : 0,950 touche X Y , entrer 0,1054, touche =, touche x, 

entrer 4,8239, touche = 

note 2: selon le chiffre obtenu ci-dessus, valider soit la touche 10 x , soit les touches INV et log 

note 3: pour convertir le résultat en UI/l, diviser le nombre obtenu par 1000. 

Si l’échantillon a été prédilué (par ex. au 1/11), multiplier l’activité en anticorps calculée (et non 

pas le signal de mesure) par 11. 

Test quantitatif (de chaque concentration du standard) : 

Pour l’exploitation quantitative, calculer la valeur moyenne de chaque concentration du standard 

(5, 10, 25, 50 et 100 UI/l) testée en double, et tracer une courbe d’étalonnage sur papier 

bilogarithmique. Abscisse: concentrations d’anti-HBs de 5 à 100 UI/l. Ordonnée: densités 

optiques de 0,05 à 2,0. La courbe d’étalonnage permet de lire les concentrations en anti-HBs 

des échantillons à partir des densités optiques obtenues. 

Si les échantillons ont été testés dilués, multiplier la concentration lue sur la courbe d’étalonnage 

par le facteur de dilution. 

OQNE G11 C0541 (906) H/R 28

Limites du test 

1. Les anticoagulants, comme l’héparine, l’EDTA ou le citrate, n’influencent pas le résultat du test. 

2. Les échantillons lipémiques, hémolytiques, contenant des facteurs rhumatoïdes ou ictériques 

ne perturbent pas le test. 

3. Les échantillons de femmes enceintes n‘ont entraîné aucune influence sur les résultats du test. 

4. Des tests ont été effectués avec des échantillons contenant les substances suivantes 

pouvant entraîner des interférences : antigène HBs, ANA, et anticorps anti-VHC, anti-VHA, 

anti-HBc, anti-HBe, anti-EBV et anti-CMV. Avec ces échantillons, aucune interférence n‘a 

été observée sur les résultats du test. 

5. On n’a pas observé de perturbations suite à l’utilisation d’échantillons traités à la chaleur (30 

min à +56°C). 

6. Ne pas utiliser de sérums insuffisamment coagulés ni d’échantillons contenant de l’azide de 

sodium ou contaminés. Les particules éventuellement présentes (par ex. des caillots de 

fibrine) doivent être éliminées avant le test. 

7. Si on utilise des échantillons décongelés, bien veiller à leur homogénéisation. 

8. Les réactifs (à l’exception de la Solution de lavage POD, de la Solution d’arrêt POD et de la 

solution d’emploi du chromogène obtenue à partir des lots de réactifs indiqués pour le 

Chromogène TMB et le Tampon/substat TMB) ne peuvent être utilisés que selon la 

combinaison des numéros de lots à 6 chiffres indiqués sur le coffret et dans le tableau des 

codes à barres joint. 

9. Le Tampon/substrat TMB, la solution d’emploi du chromogène et la Solution d’arrêt POD ne 

doivent pas entrer en contact avec des ions de métaux lourds ni des substances oxydantes 

(ne pas utiliser de pipettes à parties métalliques). La réaction du substrat ne doit pas être 

effectuée à proximité de désinfectants contenant de l’eau de Javel. Une coloration bleue 

spontanée de la solution d’emploi du chromogène avant son transfert dans la plaque indique 

une contamination ; préparer une nouvelle solution dans un récipient propre. Éviter tout 

contact de la peau avec les solutions sus-mentionnées. 

10. Les sérums de contrôle sont obtenus à partir de sérums humains natifs. Ils peuvent donc 

devenir trouble, sans que cela ait d’influence sur le résultat du test. 

11. La plaque doit rester immobile pendant toute l’incubation (la placer par ex. sur un support 

fixe ou dans un bain-marie sans circulation d’eau) ; le fond des cupules doit être en contact 

avec l’eau thermostatée. Si l’eau contient des stabilisateurs pour éviter une contamination, 

bien veiller à ce que ni la surface supérieure de la plaque ni l’intérieur des cupules n’entrent 

en contact avec cette eau, au risque d’obtenir des réactions non-spécifiques. 

12. En cas d’échantillon fortement réactif, il peut y avoir précipitation lors de l’addition de la 

Solution d’arrêt et du virage de la coloration, sans que cela ait d’influence sur l’exploitation 

photométrique. 

13. Dade Behring a validé l’utilisation de ces réactifs sur plusieurs analyseurs afin d’optimiser 

les performances du produit et répondre à ses spécifications. Les modifications apportées 

par l’utilisateur ne sont pas sous la responsabilité de Dade Behring dans la mesure où elles 

peuvent affecter les performances du système et les résultats des dosages. Il est de la 

responsabilité de l’utilisateur de valider toutes modifications apportées à ces instructions ou 

à l’utilisation des réactifs sur les analyseurs autres que ceux mentionnés dans les protocoles 

d’application Dade Behring ou dans la présente notice d’utilisation. 

14. Les résultats de ce test doivent toujours être interprétés en rapport avec les antécédents 

médicaux du patient, les signes cliniques et autres constatations. 

Caractéristiques du test 

Sensibilité et spécificité 

Les résultats de l’étude de sensibilité et de spécificité sont résumés dans les Tableaux 2 et 3 en 

annexe. 

Pour déterminer la sensibilité diagnostique, 515 échantillons anti-HBs-positifs ont été testés, 

donnant une sensibilité de 100%. La réactivité du test vis-à-vis d’échantillons en cours de 

séroconversion ou après une vaccination a été étudiée sur 41 échantillons. Dans ce domaine, 

Enzygnost * Anti-HBs II a montré une sensibilité équivalente à celle des tests comparables. 

OQNE G11 C0541 (906) H/R 29

La sensibilité analytique a été obtenue par exploitation quantitative (courbe standard) d’après la 

préparation de référence de l’OMS ayant une concentration < 8 UI/l. 

Pour déterminer la spécificité, 4736 dons de sang anti-HBs-négatifs ont été testés, donnant une 

spécificité comprise entre 99,5 et 99,7%. Selon le collectif étudié, la réalisation du test et 

d’autres paramètres, on peut obtenir des valeurs divergentes. 

Reproductibilité 

Les résultats de l’étude de reproductibilité/répétabilité sont résumés dans le Tableau 4 en 

annexe. Il s’agit de données indicatives. Des différences dans la réalisation du test par exemple 

peuvent entraîner des valeurs divergentes. 

* Enzygnost est une marque déposée de Dade Behring Marburg GmbH en Allemagne et dans 

d’autres pays. 

BEP est une marque déposée de Dade Behring Marburg GmbH aux USA, en Allemagne et dans 

d’autres pays. 


0197 




OQNE G11 C0541 (906) H/R 30

Tabl. 1 : Stabilités et conditions de conservation 

Échantillons/réactifs état conservation stabilité • 

Enzygnost * Anti-HBs II (plaque-test) après ouverture +2/+8°C 4 semaines 

dans sachet avec 

capsule dessicative 

Conjugué HBsAg/POD (Anti-HBs II) après ouverture +2/+8°C 4 semaines 

Sérum Anti-HBs 100 après ouverture +2/+8°C 4 semaines 

Sérum Anti-HBs négatif

Tabl. 4 : Reproductibilité 

Dans le cadre de l’étude de répétabilité, les échantillons ont été testés 8 fois, à 5 jours différents, 

dans deux centres indépendants (K, E). Le calcul du CV s’est fait par analyse de la variance. 


Échantillons valeur moyenne du ratio CV % 

(K) P1 0,3 13,0 

P2 1,0 5,0 

P3 3,1 2,6 

P4 11,3 2,2 

(E) F1 0,3 9,1 

F2 1,0 4,7 

F3 4,0 3,0 

F4 9,1 4,8 

F5 14,5 5,0 

Dans le cadre de l’étude de reproductibilité, les échantillons ont été testés 8 fois, à 5 jours 

différents, dans deux centres indépendants (K, E). Le calcul du CV s’est fait par analyse de la 

variance. 


Échantillons valeur moyenne du ratio CV % 

(K) P1 0,3 8,3 

P2 1,0 4,1 

P3 3,1 2,3 

P4 11,3 3,6 

(E) F1 0,3 12,9 

F2 1,0 4,0 

F3 4,0 2,2 

F4 9,1 2,2 

F5 14,5 2,5 

ratio = densité optique/valeur-seuil 

OQNE G11 C0541 (906) H/R 32

Tabl. 5 : Réalisation du test et programmation 


Réalisation du test 

Programmation du menu 


pour le 

préparation des réactifs 


4 x 100 µl de Sérum de contrôle négatif 

1 x 100 µl de Sérum de contrôle positif 

100 µl de chaque échantillon non dilué 

1 x 100 µl de Sérum de contrôle positif 


25 µl de conjugué compléter éventuellement 

la plaque à mi-plaque avec 

des barrettes remplies d’eau 

60 min à ± 2 min 

(37 ± 1 °C) 

4 lavages: BEP ® II 

100 µl de solution réalisation 

d’emploi du chromogène 

automatique du test 


+15 °C/+25 °C 

à l’abri de la lumière 

100 µl de Solution d’arrêt 

après 1 h maximum 

exploitation à 450 nm 

(longueur d’onde de 

référence : 650 nm) 

α-méthode 

résultat du test 

BEP ® 2000 

MENU NO 

OPERATE 1 

NO 

WASHINGS 

ASPIRATE 

SOAKTIME 

DISP VOL 

BEP ® III CHANNEL NO 

PHOT 

OPERATE 2 

YES 

DISTRIBUTION DU CONJUGUÉ 

WASHINGS 0 

ASPIRATE 

NO 

SOAKTIME 0 

DISP VOL 25 

CHANNEL NO 1 

PHOT 

NO 

OPERATE 3 

YES 

LAVAGE ET DISTRIBUTION DU 

CHROMOGÈNE 

WASHINGS 4 

ASPIRATE 

NO 

SOAKTIME 0 

DISP VOL 100 

CHANNEL NO 4 

PHOT 

NO 

OPERATE 4 

YES 

DISTRIBUTION DE LA SOLUTION 

D'ARRÊT 

WASHINGS 0 

ASPIRATE 

NO 

SOAKTIME 0 

DISP VOL 100 

CHANNEL NO 5 

PHOT 

YES 

MEAS WL 450 

REF WL 650 

BLK COR 

NO 

EVAL MODE 1 

GEN CUT 

NO 

NEG CONT 4 

MAX NEG 0.120 

MIN NEG - 

FACT NEG - 

MAX POS - 

THRESH 0.08 

CUT OFF - 

OQNE G11 C0541 (906) H/R 33

Enzygnost * anti-HBs II 

Settori d’impiego 

Metodo immunoenzimatico per l’identificazione qualitativa e la determinazione quantitativa degli 

anticorpi contro l’antigene di superficie dell’epatite B nel siero e nel plasma. 

L’esecuzione del test immunoenzimatico avviene su processore ELISA BEP ® II, BEP ® III e BEP ® 

2000. Il test è stato sviluppato per l’analisi di campioni singoli e non per pool di campioni. Il 

prodotto deve essere impiegato solo per scopi diagnostici in vitro. 

Significato diagnostica 

Come l’antigene di superficie dell’epatite B (HBsAg), anche l’anticorpo anti-HBs diretto contro la 

proteina di superficie è un parametro importante per la diagnosi di infezione da virus dell’epatite 

B (HBV) 1, 2 . 

Durante il periodo di incubazione e nella fase acuta dell’infezione da HBV, gli anticorpi anti- 

HBsAg non sono evidenziabili. Gli anticorpi anti-HBs, che danno l’immunità, compaiono nel 90% 

dei casi solo nella tarda convalescenza circa 3 o 4 mesi dopo l’insorgenza della malattia, quando 

l’HBsAg circolante non è più evidenziabile 3, 4 . 

Questa sieroconversione, cioè il passaggio dell’anti-HBs da negativo a positivo, rappresenta un 

parametro molto attendibile per la diagnosi di una infezione da HBV pregressa, tanto più che 

circa il 10% dei pazienti con infezione acuta, per i quali l’HBsAg nella fase iniziale non è 

rilevabile, diventa successivamente anti-HBs positiva. L’identificazione dell’anti-HBs è adatto 

anche per la diagnosi delle infezioni subcliniche da HBV 3, 4 . 

La dimostrazione degli anticorpi anti-HBs indica una esposizione precedente con questo 

antigene a causa di una infezione da HBV o in seguito a vaccinazione, ed è perciò importante 

nelle seguenti ricerche: 

a) valutazione della convalescenza, e in una certa misura, anche prognosi per pazienti con 

infezione da HBV (controllo del decorso) 

b) ricerca sierologica nel contesto dei programmi di vaccinazione (screening e controllo dello 

stato di immunizzazione) 

c) studi epidemiologici 

Oltre alla identificazione qualitativa dell’anti-HBs, la determinazione quantitativa dell’anti-HBs 

risulta rilevante dal punto di vista dell’immunizzazione attiva. Secondo le raccomandazioni del 

WHO, si può presumere una protezione contro l’infezione in seguito a vaccinazione se nel siero 

o nel plasma può essere riscontrata una concentrazione di anti-HBs superiore a 10 UI/L. Si 

raccomanda di eseguire in tempo le vaccinazioni di richiamo per garantire che i valori non siano 

al di sotto di questo limite 5, 6, 7 . 

Pazienti con una concentrazione di anticorpi anti-HBs < 100 UI/L dopo il completamento della 

vaccinazione di base, richiedono una vaccinazione di richiamo entro un anno. (Raccomandazioni della 

Commissione Permanente per le Vaccinazioni dell’Istituto Robert Koch in Germania, ottobre 1995). 

La necessità di una determinazione quantitativa risulta ulteriormente importante perché la 

durata dell’immunità è proporzionale ai livelli di anti-HBs presenti. 

Principio del metodo 

L’Enzygnost * anti-HBs II è un test ad una fase secondo il metodo sandwich. L’antigene utilizzato 

per la fase solida ed il coniugato è costituito da HBsAg umano. 

L’HBsAg marcato con perossidasi si lega agli anticorpi specifici anti-HBs presenti nel campione 

in esame. Questi si legano all’HBsAg legato alla superficie della piastra per microtitolazione 

(sandwich fra antigeni). 

Dopo l’eliminazione tramite lavaggio delle componenti non legate si determina l’attività 

enzimatica del coniugato. La reazione enzimatica del substrato e del cromogeno produce una 

colorazione blu. La reazione viene interrotta con l’aggiunta della soluzione bloccante POD ed il 

colore vira al giallo. L’intensità del colore è proporzionale alla concentrazione degli anticorpi nel 

campione. I risultati vengono quantificati mediante calcolo con il metodo α o per confronto con 

una curva standard. 

OQNE G11 C0541 (906) H/R 34 Edizione Febbraio 2004

Reagenti 

Contenuto della confezione 

Enzygnost * anti-HBs II 1x96 10x96 

Enzygnost * anti-HBs II 1 piastra test 10 piastri test 

Coniugato HBsAg/POD (anti-HBs II) 1 x 6 mL 10 x 6 mL 

Siero anti-HBs 100 1 x 1,5 mL 3 x 1,5 mL 

Siero anti-HBs negativo 2 x 14 mL 5 x 14 mL 

Soluzione di lavaggio POD (concentrata)** 1 x 100 mL 2 x 100 mL 

Tampone/substrato TMB** 1 x 30 mL 4 x 30 mL 

Cromogeno TMB** 1 x 3 mL 4 x 3 mL 

Soluzione bloccante POD** 1 x 100 mL 2 x 100 mL 

Flacone vuoto per la soluzione d’uso del cromogeno 1 pz 1 pz 

Fogli adesivi 6 pz 24 pz 

Sacchetti in PE 1 pz 1 pz 

Tabella con codice a barre 1 pz 1 pz 

Istruzioni per l’uso 1 pz 1 pz 

Ulteriori confezioni: 100 x 96 

** Questi componenti sono inclusi anche nel Kit Reagenti Supplementari per Enzygnost* TMB 

(codice OUVP). 

Composizione 

Enzygnost * anti-HBs II: piastra da microtitolazione sensibilizzata con HBsAg inattivato 

(sottotipi ad e ay) isolato da sangue umano. 

Coniugato HBsAg/POD (anti-HBs II): HBsAg inattivato coniugato con perossidasi (POD), 

isolato da sangue umano, tampone Tris (circa 100 g/L), NaCl (circa 47 g/L). 

Conservante: fenolo (max 1 g/L) 

Siero anti-HBs 100: siero umano anti-HBs (concentrazione nominale 100 ± 25 UI/L), calibrato 

nei confronti del Preparato di Riferimento del WHO, valore nominale di estinzione: ≥ 0,7 

Conservanti: amfotericina (circa 5 mg/L) 

gentamicina (circa 100 mg/L) 

Siero anti-HBs, negativo: siero umano, valore nominale di estinzione: ≤ 0,12 

Conservanti: amfotericina (circa 5 mg/L) 

gentamicina (circa 100 mg/L) 

Soluzione di lavaggio POD (concentrata): soluzione tampone fosfato (90 mmol/L) contenente 

Tween 

Conservante: fenolo (max 1 g/L) 

Tampone/substrato TMB: perossido d’idrogeno (circa 1 g/L) in soluzione tampone acetato (25 

mmol/L) 

Conservante: n-butanolo (circa 10 mL/L) 

Cromogeno TMB: tetrametibenzidina-cloridrato (5 g/L) 

Soluzione bloccante POD: acido solforico 0,5 N 

OQNE G11 C0541 (906) H/R 35

Avvertenze e precauzioni 

1. Per uso diagnostico in vitro. 

2. Ogni donazione di sangue utilizzata per la produzione dei controlli dell'Enzygnost * anti-HBs II 

è stata esaminata per la ricerca dell' HBsAg e degli anticorpi anti-HCV, anti HIV1 e anti-HIV2. 

Solo i campioni risultati negativi sono stati impiegati per la produzione. 

Tuttavia, tutti i derivati da sangue umano devono essere trattati con le necessarie precauzioni 

rispettando le norme di sicurezza sul rischio biologico 8 , in quanto non è possibile escludere 

con assoluta certezza il pericolo di agenti patogeni. 

3. L'HBsAg impiegato per la produzione della piastra test e del coniugato POD è stato isolato, 

con elevato grado di purezza, da plasmi umani positivi per l'HBsAg e negativi ai test anti-HCV, 

anti-HIV1 ed anti-HIV2, ed è stato sottoposto ad un accurato processo di inattivazione. 

4. Si consiglia l’uso di guanti di protezione durante l’intera esecuzione del test. 

5. Per lo smaltimento del materiale solido infettivo si consiglia il trattamento in autoclave per 

almeno 1 ora a +121 °C. Tutti i liquidi aspirati devono essere raccolti in due contenitori 

collegati in serie, i quali dovrebbero contenere un disinfettante adatto all’inattivazione dei virus 

patogeni umani. Osservare le concentrazioni ed i tempi di azione indicati dal produttore. 

Preparazione dei reagenti 

Prima dell’inizio del test portare tutti i reagenti ed i campioni in esame a +15/+25 °C (non togliere 

la piastra test dal sacchetto di alluminio). 

Le file di pozzetti non necessarie devono essere tolte dal supporto e conservate per 

l’utilizzazione successiva (vedere Tabella 1). 

Per ogni piastra test diluire 20 mL di soluzione di lavaggio POD con 400 mL di acqua distillata 

o deionizzata. 

Per ogni piastra test diluire 1 mL di cromogeno TMB con 10 mL di tampone/substrato TMB 

nel flacone vuoto fornito nella confezione (soluzione d’uso del cromogeno) e conservare al 

riparo dalla luce. Dopo l’uso lavare accuratamente il flacone con acqua distillata. 

A causa della dimensione del flacone non è possibile versare il cromogeno TMB direttamente 

nel flacone del tampone/substrato. 

Prediluizione dei campioni: per l’analisi quantitativa i campioni in cui si sospetta una 

concentrazione di anti-HBs ≥ 100 UI/L dovrebbero essere diluiti come segue: 

fino a 1000 UI/L: diluire 

fino a 10.000 UI/L: diluire 

1:10 (ad esempio 20 µL+180 µL siero anti-HBs negativo) 

1:100 (ad esempio 20 µL+180 µL siero anti-HBs negativo; successivamente 

20 µL della prima diluizione + 180 µL siero anti HBs negativo) 

fino a 100.000 UI/L: diluire 1:1000 (ad esempio 20 µL+180 µL siero anti-HBs negativo; successivamente 

20 µL della prima diluizione + 180 µL siero anti HBs negativo; successivamente 

20 µL della prima diluizione + 180 µL siero anti HBs negativo) 

Se la valutazione quantitativa del test viene ottenuta utilizzando una serie di diluizioni, è 

necessario preparare inoltre le seguenti diluizioni del Siero anti-HBs 100 utilizzando il Siero anti- 

HBs negativo (ciò non vale se la valutazione viene eseguita con il metodo α) : 

50 UI/L: diluizione 1:2 (es.: 200 µL di siero anti-HBs (100) + 200 µL di siero di negativo anti-HBs) 

25 UI/L: diluizione 1:4 (es.: 150 µL dello siero 50 UI/L + 150 µL di siero di negativo anti-HBs) 

10 UI/L: diluizione 1:10 (es.: 50 µL di siero anti-HBs 100 + 450 µL di siero di negativo anti-HBs) 

5 UI/L: diluizione 1:20 (es.: 150 µL dello siero 10 UI/L + 150 µL di siero di negativo anti-HBs) 

Conservazione e validità 

Prima dell'apertura, tutte le componenti della confezione possono essere utilizzate fino alla data 

di scadenza indicata in etichetta, purché conservate a + 2/+ 8 °C. 

La conservazione e la validità dei reagenti pronti per l'uso, dopo l'apertura, sono riportate in 

appendice nella Tabella 1. 

OQNE G11 C0541 (906) H/R 36

Strumentazione necessaria 

BEP ® II: Per la dispensazione automatica dei reagenti e della soluzione di lavaggio 

BEP ® III: Per l’esecuzione automatica e valutazione del test, dopo la distribuzione dei 

campioni 

BEP ® 2000: per l’esecuzione automatica del test e la valutazione dei risultati 

Pipette: Pipette automatiche da 25, 100 e 1000 µl. 

Sistema di incubazione: bagnomaria coperto (+ 37 ± 1°C) o analoghi metodi di incubazione. 

Tutta la strumentazione usata nel test deve essere validata. 

Campioni in esame 

Si impiegano come campioni in esame quelli singoli (siero umano o plasma citratato/ 

eparinizzato/EDTA) ottenuti da tecniche standard di laboratorio. I campioni devono essere 

conservati a + 2/+ 8°C per non più di 3 giorni. Se i campioni devono essere conservati per un 

lungo periodo di tempo, devono essere congelati. 

Esecuzione del test 

Esecuzione del test con il BEP ® II 

1. Schema del test: accertare il numero di pozzetti necessari (= numero dei campioni più 6 

pozzetti per i controlli) 

2. Distribuzione dei campioni: 

Test qualitativo/Test quantitativo ( metodo α ) 

dispensare 100 µL/pozzetto di siero anti-HBs negativo in 4 pozzetti (A1-D1) e 100 µL di siero 

anti-HBs 100 nel pozzetto E1. Dispensare nei pozzetti successivi 100 µL/pozzetto dei 

campioni. Alla fine della serie o della piastra dispensare in un ulteriore pozzetto 100 µL di 

siero anti-HBs 100. 

Effettuare la fase di dispensazione rapidamente entro un massimo di 15 minuti per ogni 

piastra. 

Importante: 

Non è consentito distribuire prima il siero anti-HBs 100 in tutte le posizioni previste e 

successivamente interporre i campioni. 

Test quantitativo (diluizioni standard) 

Distribuire 100 µL di siero negativo anti-HBs in ognuno dei primi 4 pozzetti e successivamente 

distribuire in doppio 100 µL di siero anti-HBs per ognuna delle diluizioni 100, 50, 25, 10 e 5 UI/L. 

Distribuire 100 µL di campione (evtl. prediluiti secondo la necessità) in ognuno dei successivi 

pozzetti. 

Immediatamente dopo la dispensazione dei campioni procedere con la dispensazione del 

coniugato. 

3. Distribuzione del coniugato: dispensare 25 µL di coniugato HBsAg/POD (anti-HBs II) in 

ogni pozzetto. 

Ricoprire quindi con un foglio adesivo. La micropiastra deve essere inserita nel sistema di 

incubazione immediatamente dopo la distribuzione del coniugato. 

4. Incubazione: incubare la piastra per 60 ± 2 minuti a 37 ± 1 °C; procedere quindi immediatamente 

con la fase di lavaggio. 

5. Lavaggio: rimuovere il foglio adesivo ed aspirare il contenuto dei pozzetti; lavare 4 volte con 

circa 0,3 mL/pozzetto di soluzione di lavaggio. Conclusa la fase di lavaggio effettuare subito 

la dispensazione del reagente successivo per evitare l’essiccamento dei pozzetti. 

6. Distribuzione del substrato: dispensare in ogni pozzetto 100 µL della soluzione d’uso del 

cromogeno e coprire la piastra con un nuovo foglio adesivo. 

7. Incubazione: incubare per 30 ± 2 minuti a +15/+25 °C al riparo della luce. 

8. Arresto della reazione: rimuovere il foglio adesivo e dispensare in ogni pozzetto 100 µL di 

soluzione bloccante POD, con la stessa cadenza di tempo seguita per la distribuzione del 

substrato (punto 6). 

9. Lettura fotometrica: effettuare la lettura a 450 nm entro 1 ora. La lunghezza d’onda di 

riferimento raccomandata è di 650 nm (eventualmente tra 615 e 690 nm). 

OQNE G11 C0541 (906) H/R 37

Esecuzione del test usando il BEP ® III 

Prima di utilizzare il BEP ® III, preparare le piastre test ed eseguire le operazioni di 

dispensamento dei campioni (Paragrafo 1 e 2 in ”Esecuzione del test con il BEP ® II”). Subito 

dopo porre le piastre non coperte da foglio adesivo nel BEP ® III. Attenzione: le piastre 

parzialmente riempite devono essere completate almeno a metà piastra (6 strip) aggiungendo 

”strip riempite con acqua”. Il test viene quindi eseguito in modo completamente automatico (v. 

Manuale d’uso BEP ® III). 

Le impostazioni per i periodi di incubazione nel software del BEP ® III possono differire dai periodi 

del BEP ® II per motivi tecnici (velocità del sistema), ma sono state validate per i metodi 

Enzygnost * sul BEP ® III. 

Esecuzione del test usando il BEP ® 2000 

Le fasi di dispensazione del campione e la successiva esecuzione del test sono eseguite in 

maniera completamente automatica dall’analizzatore (v. manuale d’uso del BEP ® 2000). 

Criteri di validità del test 

I valori individuali di estinzione dei sieri di controllo vengono utilizzati per calcolare il valore 

medio quando: 

-0,010 ≤ E neg. ≤ 0,120 

E siero anti-HBs 100 ≥ 0.7 

Se uno dei quattro valori di estinzione dei controlli negativi non rientra nell’ambito indicato, può 

essere trascurato. 

Entrambi i valori di estinzione del siero anti-HBs 100 devono rientrare nell’ambito indicato. 

Se queste condizioni non vengono rispettate, il test deve essere ripetuto. 

Per il test quantitativo si applicano i seguenti criteri di validità: 

Se si utilizza una serie di diluizioni: 

E neg ≤ E standard 5 UI/L 

Se si utilizza il metodo α : 

Le singole letture fotometriche del Siero anti-HBs 100 vengono utilizzate per calcolare la media, 

a condizione che : 

limite inferiore < E siero anti-HBs 100 < limite superiore 

I valori per il limite inferiore e superiore sono riportati nell’allegata tabella dei valori. 

Entrambi i valori di estinzione del siero anti-HBs 100 devono essere compresi nell’ambito 

indicato. 

Inoltre, i singoli valori non devono differire di oltre il 20 % dalla media di questi due valori. 

Se queste condizioni non vengono rispettate, il test può essere valutato solo dal punto di vista 

qualitativo. 

Valutazione del test 

Sul BEP ® 2000 e BEP ® III, il calcolo dei risultati viene eseguito automaticamente. Consultare il 

rispettivo manuale d’uso. I seguenti capitoli permettono la valutazione dei risultati senza l’ausilio 

del software. 

Test qualitativo 

Calcolare il valore medio di estinzione dei controlli negativi e quindi calcolare il cut-off 

aggiungendo 0,08: 

– 

E neg +0,08 = cut-off 

I campioni in base ai criteri del test vengono classificati come segue: 

1. E campione < cut-off = anti-HBs negativo 

2. E campione > cut-off = anti-HBs positivo 

OQNE G11 C0541 (906) H/R 38

Test quantitativo (metodo α) 

Per ogni piastra test utilizzata viene calcolato un fattore di correzione utilizzato per correggere i 

valori di estinzione di ogni singolo campione (correzione della misura). I valori di assorbanza 

corretti vengono quindi utilizzati per calcolare l’attività anticorpale (vedere «Calcolo dei risultati»). 

Correzione della misura 

Il fattore di correzione viene calcolato dalla formula seguente: 

Valore nominale 

Fattore di correzione = ––––––––––––––––––––––––––––– 

Valore medio del siero anti-HBs 100 

Il valore nominale è riportato nella tabella dei valori acclusa. I valori di estinzione dei campioni 

vanno moltiplicati per il fattore di correzione. I valori di estinzione corretti ottenuti vengono quindi 

utilizzati per il calcolo dei risultati. 

Se vengono utilizzate varie piastre test, il fattore di correzione deve essere determinato 

separatamente per ogni singola piastra ed utilizzato per la correzione dei valori di estinzione 

della piastra corrispondente. 

Calcolo dei risultati 

Per calcolare l’attività anticorpale, i valori di estinzione corretti dei campioni, vengono utilizzati 

nella seguente formula (metodo α) 

log 10 mUI/L = α . E β 

dove α e β sono delle costanti lotto-dipendenti e sono riportate nella tabella dei valori acclusa. I 

risultati dell’attività anticorpale espressi in «UI/L» sono riferiti al Preparato di Riferimento 

Internazionale per l’HBV del WHO. 

Importante: NON utilizzare nella formula i dati seguenti: 

-valori di estinzione corretti < cut-off 

-valori di estinzione non corretti > 2,5 

Esempio di calcolo 

Valore assegnato ad α 4,8239 

Valore assegnato a β 0,1054 

Lettura corretta di un campione in esame 0,950 

log 10 mUI/L (dalla formula) 4,7979 (vedi nota 1) 

l’antilogaritmo (=mUI/L) è 62790 (vedi nota 2) 

attività anticorpale in (UI/L) 62,79 (vedi nota 3) 

nota 1: Con la calcolatrice tascabile: digitare 0,950 tasto X Y digitare 0,1054, tasto =, tasto X, 

digitare 4,8239, tasto = 

nota 2: Dopo la cifra ottenuta con il calcolo precedente premere il tasto 10 X o i tasti INV e log. 

nota 3: Per la trasformazione in UI/L il numero precedente dev’essere diviso per 1000 

Se il campione è stato prediluito (es. 1:11), l'attività anticorpale calcolata (non l'assorbanza) 

deve essere moltiplicata per 11. 

Test quantitativo (diluizioni standard) 

Per la valutazione quantitativa si valutano i valori medi di estinzione della determinazione in 

doppio delle diluizioni standard 5, 10, 25, 50 e 100 UI/L. Viene allestita una curva di calibrazione 

su carta bilogaritmica. 

Ascissa: concentrazione di anti-HBs da 5 a 100 UI/L. Ordinata: valori di estinzione da 0,05 a 2,0. 

Le concentrazioni di anti-HBs dei campioni si leggono dalla curva di calibrazione sulla base dei 

singoli valori di estinzione. 

Se i campioni sono stati diluiti, moltiplicare la concentrazione che si ottiene dalla curva di 

calibrazione per il fattore di diluizione. 

OQNE G11 C0541 (906) H/R 39

Limitazioni della esecuzione del test 

1. Anticoagulanti come l’eparina, l’EDTA ed il citrato non interferiscono con il test. 

2. Campioni lipemici, emolizzati, itterici o contenenti fattori reumatoidi non influenzano i risultati 

del test. 

3. Nessuna interferenza con il risultato del test è stata osservata con campioni di donne in 

gravidanza. 

4. I campioni contenenti le seguenti potenziali fonti di interferenze sono stati controllati nel test: 

antigene HBs, ANA e anticorpi anti-HCV, HAV, HBc, HBe, EBV e CMV. Nessuna interferenza 

con il risultato del test è stata osservata con i campioni utilizzati. 

5. Non sono state riscontrate interferenze nei campioni trattati al calore (30 minuti a 56 °C). 

6. Non dovrebbero essere utilizzati campioni di siero da sangue non completamente coagulato, 

che contengano sodio azide o presentano contaminazione batterica. Ogni particella presente 

nel campione (ad esempio coaguli di fibrina) dovrebbe essere eliminata prima dell’uso. 

7. Quando si utilizzano campioni scongelati, assicurarsi di una buona omogeneizzazione del 

materiale prima dell’uso. 

8. E' necessario utilizzare solo reagenti appartenenti tutti ad uno stesso lotto (ad esclusione della 

soluzione di lavaggio POD, la Soluzione bloccante POD e la Soluzione d'uso del cromogeno 

preparata con i reagenti Cromogeno TMB e Tampone/Substrato TMB appartenenti tutti allo 

stesso lotto). La combinazione ammessa dei numeri di lotto a 6 cifre e quella stampata sulla 

confezione ed anche riportata nell'allegata tabella dei codici a barre. 

9. Il tampone/substrato TMB, la soluzione d’uso del cromogeno e la soluzione bloccante POD 

non devono entrare in contatto con ioni di metalli pesanti o sostanze ossidanti (non utilizzare 

pipette con parti metalliche a contatto con il liquido!). Non eseguire la reazione con il substrato 

in presenza di disinfettanti contenenti ipoclorito. Se la soluzione d’uso del cromogeno si colora 

spontaneamente di blu prima del dispensamento nella piastra test significa che la soluzione è 

stata contaminata; in tal caso preparare nuovamente la soluzione fresca in un contenitore 

pulito. Evitare il contatto di queste soluzioni con la cute. 

10. Il siero di controllo è stato ottenuto da siero umano nativo. Possono manifestarsi intorbidamenti, 

che però non interferiscono sui risultati del test. 

11. Durante la fase di incubazione la piastra test deve rimanere immobile (ad esempio utilizzare un 

supporto fisso ed evitare bagnomaria a circolazione d’acqua); i pozzetti della piastra devono 

essere a contatto con l’acqua termostatata. Se vengono utilizzati stabilizzanti per evitare la 

contaminazione batterica dell’acqua, occorre fare attenzione che la superficie della piastra test 

ed i pozzetti non vengano a contatto con queste soluzioni, in quanto simili contaminazioni 

possono produrre reazioni aspecifiche. 

12. In presenza di campioni fortemente reattivi si può verificare la formazione di un precipitato 

entro la soluzione colorata. Tuttavia la valutazione fotometrica non viene compromessa. 

13. Dade Behring ha validato l’uso di questi reagenti su vari analizzatori per ottimizzare le 

prestazioni e rispettare le specifiche dei prodotti. Le modifiche definite dall’utente non sono 

supportate da Dade Behring poiché possono influire sulle prestazioni del sistema e sui 

risultati del test. Pertanto è responsabilità dell’utente validare tutte le modifiche apportate a 

queste istruzioni, l’uso dei reagenti su analizzatori diversi da quelli inclusi nei fogli di 

istruzioni o nelle istruzioni d’uso fornite da Dade Behring. 

14. I risultati di questo test devono essere sempre interpretati alla luce della anamnesi del 

paziente, della presentazione clinica e valutando contestualmente l’esito di altri 

accertamenti. 

Caratteristiche del test 

Sensibilità e specificità 

I risultati degli studi di sensibilità e specificità sono riportati in appendice nelle Tabelle 2 e 3. 

La sensibilità diagnostica è stata stabilita analizzando 515 campioni positivi per l’anti-HBs ed il 

valore riscontrato è stato del 100 %. La reattività del test nei confronti dei campioni di 

sieroconversione/profili di vaccinazione è stata investigata utilizzando 41 profili. L’Enzygnost * 

anti-HBs II ha presentato un grado di sensibilità confrontabile con altri test. 

OQNE G11 C0541 (906) H/R 40

La sensibilità analitica del test, determinata con una valutazione quantitativa (curva standard) 

utilizzando il Preparato di Riferimento del WHO, è risultata essere < 8 UI/l. 

Per stabilire la specificità del test sono stati analizzati un totale di 4736 campioni di donatori 

negativi per l’anti-HBs ed il risultato ottenuto è stato del 99,5 - 99,7 %. Valori differenti possono 

essere riscontrati in funzione del tipo di popolazione, del metodo d’analisi utilizzato e di altri 

fattori. 

Riproducibilità 

I risultati degli studi di riproducibilità intra/inter assay sono riportati in appendice nella Tabella 4. 

Questi dati sono un esempio. Valori differenti possono essere ottenuti in funzione di vari fattori 

come il metodo etc. 

* Enzygnost è un marchio registrato della Dade Behring Marburg GmbH negli Germania e altri paesi. 

BEP è un marchio registrato della Dade Behring Marburg GmbH negli Stati Uniti, Germania e 

altri paesi 


0197 




OQNE G11 C0541 (906) H/R 41

Tabella 1: Conservazione e validità 

Reagenti Condizioni Conservazione Stabilità • 

Enzygnost * Anti-HBs II (piastra test) dopo apertura +2/+8 °C 4 settimane 

nel sacchetto 

con l’essiccante 

Coniugato HBsAg/POD (Anti-HBsII) dopo apertura +2/+8 °C 4 settimane 

Siero anti-HBs 100 dopo apertura +2/+8 °C 4 settimane 

Siero anti-HBs, negativ < –20 °C 3 mesi 

Cromogeno TMB dopo apertura +2/+8 °C data di scadenza 

Tampone/substrato TMB dopo apertura +2/+8 °C data di scadenza 

Soluzione d’uso del cromogeno diluito +2/+8 °C 5 giorni 

1 + 10 +15/+25 °C 8 ore 

ben chiuso 

protetto 

dalla luce 

Soluzione di lavaggio POD dopo apertura +2/+8 °C data di scadenza 

(concentrata) diluita 1:20 +2/+8 °C 1 settimana 

diluita 1:20 +18/+25 °C 1 giorno 

Soluzione bloccante POD dopo apertura +2/+8 °C data di scadenza 

• in nessun caso superare la data di scadenza. 

Tabella 2: Sensibilità 

Gli studi sulla sensibilità, eseguiti su differenti gruppi di campioni, hanno dato i seguenti risultati: 

Numero di Reattivi con l’Enzygnost * 

Popolazione dei campioni campioni anti-HBs II 

anti-HBs positivi (Germania) 106 106 

anti-HBs positivi (America) 52 52 

Campioni di follow-up 25 25 

anti-HBs positivi 100 100 

Differenti stadi di infezione da HBV 41 41 

vaccinati (HBV) 111 111 

anti-HBs positivi 80 80 

profili di vaccinazione 32 profili Sensibilità equivalente 

sieroconversione 9 profili a quella di test 

confrontabili 

Tabella 3: Specificità 

Gli studi sulla specificità, eseguiti su campioni di differenti banche del sangue, hanno dato i 

seguenti risultati: 

Numero di Reattivi con l’Enzygnost * 

Popolazione dei campioni campioni anti-HBs II 

Sieri normali negativi 2296 11 

Plasmi normali negativi 646 2 

Sieri normali negativi 1508 5 

Plasmi normali negativi 286 1 

OQNE G11 C0541 (906) H/R 42

Tabella 4: Riproducibilità 

Negli studi di riproducibilità intra-assay i campioni sono stati analizzati in repliche di 8 per 5 giorni 

in due centri indipendenti (K, E). I CV sono stati calcolati secondo il modello di varianza del 

componente. 


Campione Radio media % CV 

(K) P1 0,3 13,0 

P2 1,0 5,0 

P3 3,1 2,6 

P4 11,3 2,2 

(E) F1 0,3 9,1 

F2 1,0 4,7 

F3 4,0 3,0 

F4 9,1 4,8 

F5 14,5 5,0 

Negli studi di riproducibilità inter-assay i campioni sono stati analizzati in repliche di 8 per 5 giorni 

in due centri indipendenti (K, E). I CV sono stati calcolati secondo il modello di varianza del 

componente. 


Campione Radio media % CV 

(K) P1 0,3 8,3 

P2 1,0 4,1 

P3 3,1 2,3 

P4 11,3 3,6 

(E) F1 0,3 12,9 

F2 1,0 4,0 

F3 4,0 2,2 

F4 9,1 2,2 

F5 14,5 2,5 

Ratio = Estinzione/cut-off 

OQNE G11 C0541 (906) H/R 43

Tabella 5: Esecuzione e programmazione del test 

Esecuzione del test 


BEP II ® 

Preparazione dei reagenti 

4 x 100 µL Siero di controllo, negativo 

1 x 100 µL Siero di controllo, positivo 

100 µL per campioni non diluiti 

1 x 100 µL Siero di controllo, positivo 


25 µL Nel caso di piastre 

del coniugato 

riempite parzialmente, 

aggiungere file di pozzetti 

con acqua fino a riempire 

mezza piastra test. 

60 ± 2 min 

(a 37 ± 1 °C) 

4 lavaggi BEP ® II 

100 µL Soluzione d’uso Esecuzione 

del cromogeno 

automatica del test 

30 ± 2 min 

a +15 /25 °C 

al riparo della luce 

100 µL Soluzione bloccante 

al massimo entro 1 ora 

Lettura a 450 nm (lunghezza 

d’onda di riferimento: 650 nm) 

metodo α 

Risultati 


Programmazione 

del menù per il 


BEP ® 2000 

MENU NO 

OPERATE 1 

NO 

WASHINGS 

ASPIRATE 

SOAKTIME 

DISP VOL 

CHANNEL NO 

PHOT 

OPERATE 2 

YES 

DISPENSAZIONE CONIUGATO 

WASHINGS 0 

ASPIRATE 

NO 

SOAKTIME 0 

DISP VOL 25 

CHANNEL NO 1 

PHOT 

NO 

OPERATE 3 

YES 

LAVAGGIO E DISPENSAZIONE 

CHROMOGENO 

WASHINGS 4 

ASPIRATE 

NO 

SOAKTIME 0 

DISP VOL 100 

CHANNEL NO 4 

PHOT 

NO 

OPERATE 4 

YES 

DISPENSAZIONE SOLUZIONE 

BLOCCANTE 

WASHINGS 0 

ASPIRATE 

NO 

SOAKTIME 0 

DISP VOL 100 

CHANNEL NO 5 

PHOT 

YES 

MEAS WL 450 

REF WL 650 

BLK COR 

NO 

EVAL MODE 1 

GEN CUT 

NO 

NEG CONT 4 

MAX NEG 0.120 

MIN NEG - 

FACT NEG - 

MAX POS - 

THRESH 0.08 

CUT OFF - 

OQNE G11 C0541 (906) H/R 44


Campos de aplicación 

Prueba inmunoenzimática para la determinación cualitativa y cuantitativa del anticuerpo contra 

el antígeno de superficie de la hepatitis B (HBsAg) en suero y en plasma. 

La realización del ensayo inmunológico se lleva a cabo en los ELISA Procesadores BEP ® II, BEP ® 

III y BEP ® 2000. El test se desarrolló para la investigación de muestras individuales, no de muestras 

en pool. El producto debe ser usado únicamente en diagnósticos in vitro. 

Significado diagnóstico 

Al igual que el antígeno de superficie de la hepatitis B (HBsAg), el anticuerpo dirigido contra la 

proteína de la superficie, Anti-HBs, es también un parámetro importante en el diagnóstico de 

una infección con el virus de la hepatitis B (HBV) 1, 2 . 

Durante el tiempo de incubación y durante la fase aguda de una infección con HBV no se 

pueden reconocer anticuerpos contra el HBsAg. La inmunidad otorgada a los anticuerpos anti- 

HBs aparece en el 90% de todos los casos solamente al final de la convalecencia, 

aproximadamente entre 3 y 4 meses después del comienzo de la enfermedad, cuando ya no se 

puede reconocer más el HBsAg circulante 3, 4 . 

Esta seroconverción, esto es el paso del anti-HBs negativo a positivo, representa un parámetro 

verdaderamente confiable para una infección por HBV terminada, cuanto más, cuando 

aproximadamente un 10% de los pacientes con una infección aguda, para los cuales en la fase 

inicial no se encontró ningún HBsAg, también se van a volver más tarde anti-HBs positivos. Por 

esta razón, la determinación del anti-HBs es apropiada también para el diagnóstico de 

infecciones por HBV que se desarrollan de forma no aparente 3, 4 . 

Ya que un reconocimiento positivo del anti-HBs está indicando una exposición anterior con este 

antígeno ya sea mediante una infección por HBV o en forma de una vacuna, las investigaciones 

siguientes resultan ser las aplicaciones más importantes de la determinación del anti-HBs: 

a) Juicio sobre la convalecencia y en cierta forma sobre la prognosis de pacientes infectados 

por HBV (control del desarrollo). 

b) Investigaciones serológicas dentro del marco de un programa de vacunación (screenig y 

controles de inmunización). 

c) Encuestas epidemiológicas. 

Junto a la determinación cualitativa del anti-HBs la determinación cuantitativa del anti-HBs ha 

logrado obtener, desde el punto de vista de la inmunización activa, su propio significado. De 

acuerdo a una recomendación de la OMS se puede hablar de una protección contra la infección 

después de una vacunación cuando se puede determinar en el suero o en el plasma una 

concentración de anti-HBs > 10 UI/l. Se recomienda efectuar vacunaciones de recuerdo 

oportunamente para asegurar que no se queda debajo de este valor límite 5, 6, 7 . 

Para valores de anti-HBs < 100 UI/l después de la inmunización básica es indicado, de acuerdo 

con las recomendaciones para vacunación de la Comisión permanente de Vacunación del 

Instituto Robert-Koch (Alemania) (STIKO estado en octubre de 1995), realizar una vacunación 

de recuerdo dentro del plazo de un año. 

La necesidad de una cuantificación se va ha reforzar adicionalmente por el hecho de que la 

duración de la protección de la vacuna es proporcional a la concentración de anti-HBs 

alcanzada después de la vacunación. 

Principio del método 

El Enzygnost * Anti-HBs II es un ensayo de una etapa, construido de acuerdo al principio de sandwich. 

Como antígeno de la fase fija y como antígeno conjugado se va a utilizar el HBsAg humano. 

El HBsAg marcado con peroxidasa se va a unir al anticuerpo específico contra el HBs contenido en la 

muestra. Estos se van a unir luego al HBsAg unido a la superficie de la placa de microtitulación 

(antígeno-sandwich). 

Después de eliminar con agua los componentes no ligados se determina la actividad enzimática 

fijada del conjugado. La transformación enzimática del sustrato y del cromógeno (reacción cromática 

azul) se interrumpe por adición de la solución de parada POD (reacción cromática amarilla). La 

intensidad del color es proporcional a la concentración de anticuerpo existente en la muestra. La 

cuantificación se realiza según el método-α o por comparación con una curva de referencia. 

OQNE G11 C0541 (906) H/R 45 Edición Febrero 2004

Reactivos 

Contenido del envase comercial 


Enzygnost * Anti-HBs II 1 placa de prueba 10 placas de prueba 

Conjugado HBsAg/POD (Anti-HBs II) 1 x 6 ml 10 x 6 ml 

Suero 100 anti-HBs 1 x 1,5 ml 3 x 1,5 ml 

Suero anti-HBs, negativo 2 x 14 ml 5 x 14 ml 

Solución de lavado POD (concentrado)** 1 x 100 ml 2 x 100 ml 

Tampón/sustrato TMB** 1 x 30 ml 4 x 30 ml 

Cromógeno TMB** 1 x 3 ml 4 x 3 ml 

Solución de parada POD** 1 x 100 ml 2 x 100 ml 

Frasco vacío para preparar la solución de cromógeno 1 unidad 

1 unidad 

Láminas adhesivas 6 unidades 24 unidades 

Bolsa de PE 1 unidad 1 unidad 

Tabla do código de barras 1 unidad 1 unidad 

Boletín informativo 1 unidad 1 unidad 

Otros envases comerciales: 100 x 96 

** Estos componentes también vienen includíos en el kit de Reactivos complmentarios para 

Enzygnost* TMB (N° de pedido OUVP). 

Composición 

Enzygnost * Anti-HBs II (placa de prueba): placa de microtitulación recubierta con HBsAg 

inactivado (subtipo ad y ay), el cual fue aislado de sangre humana. 

Conjugado HBsAg/POD (anti-HBs II): HBsAg inactivado, de sangre humana, conjugado con 

peroxidasa (POD), Tris (aprox. 100 g/l), NaCl (aprox. 47 g/l). 

Agente de conservación: Fenol (máx. 1 g/l) 

Suero 100 anti-HBs: Suero humano anti-HBs (valor nominal 100 ± 25 UI/l), relacionado con un 

preparado de referencia de la OMS, valor teórico de extinción ≥ 0,7 

Agentes de conservación: Anfotericina (aprox. 5 mg/l) 

Gentamicina (aprox. 100 mg/l) 

Suero anti-HBs, negativo: Suero humano, valor teórico de extinción ≤ 0,12 

Solución de lavado POD (concentrado): Solución tampón de fosfato (90 mmol/l) conteniendo 

Tween 

Agente de conservación: Fenol (máx. 1 g/l) 

Tampón/sustrato TMB: Peróxido de hidrógeno (aprox. 0,1 g/l) en solución tampón de acetato 

(25 mmol/l) 

Agente de conservación: n-Butanol (máx. 10 ml/l) 

Cromógeno TMB: Dihidrocloruro de tetrametilbencidina (5 g/l) 

Solución de parada POD: Ácido sulfúrico 0,5N 

OQNE G11 C0541 (906) H/R 46

Advertencias y medidas de seguridad 

1. Sólo para ser utilizado en diagnósticos in-vitro 

2. Cada donación individual de sangre, destinada a la preparación de los sueros de control del 

Enzygnost * Anti-HBs II ha sido investigada para detectar la presencia de HBsAg, anti-HCV, 

anti-HIV1 y anti-HIV2. En la elaboración sólo se utilizan donaciones con resultados negativos. 

Independientemente de esto, todos los materiales obtenidos a partir de sangre humana deben 

ser manipuladas con las precauciones necesarias, siguiendo las medidas de seguridad 

recomendadas en caso de riesgo biológico, puesto que nunca se puede excluir completamente 

la existencia de agentes patógenos 8 . 

3. El HBsAg, utilizado para la elaboración de las placas de prueba y del conjugado POD, fue 

aislado de plasmas humanos de alta pureza y fue sometido a un proceso de inactivación 

conocido. Sólo se utilizan plasmas humanos con resultados negativos con respecto a anti- 

HCV, anti HIV1 y anti HIV2. 

4. Se aconseja utilizar guantes de seguridad durante el desarrollo del test. 

5. Para la eliminación del material infeccioso sólido se recomienda colocarlo en el autoclave por 

lo menos 1 hora a + 121°C. Todas las soluciones aspiradas se deben recoger en dos 

recipientes conectados uno con el otro. Estos recipientes deben contener un medio de 

desinfección apropiado para inactivar virus patógenos humanos. Deben observarse la 

concentración y el tiempo de acción dados por el fabricante. 

Preparación de reactivos 

Calentar todos los reactivos y las muestras a una temperatura entre +15 y +25°C antes de iniciar 

el test, sin sacar la placa de pruebas del recipiente que la contiene. 

Los elementos de la placa de prueba no necesarios para el desarrollo del test deben ser 

retirados del soporte y almacenados para un uso posterior (ver Tabla 1). 

Para cada placa de prueba diluir 20 ml de solución de lavado POD con agua destilada o 

desionizada hasta obtener 400 ml. 

Para cada placa de prueba diluir 1 ml de cromógeno TMB con 10 ml de tampón/sustrato 

TMB en el frasco plástico vacío adjunto (solución de uso del cromógeno) y guardarlo cerrado y 

protegido de la luz. Después de su uso, enjuagar cuidadosamente el frasco con agua destilada. 

Por razones técnicas (sobrellenado) no está permitido verter el contenido del cromógeno TMB 

en el frasco de tampón/sustrato TMB. 

Predilución de las muestras: Para el desarrollo cuantitativo del test, las muestras para las 

cuales se espera una concentración de anti-HBs ≥ 100 UI/l, se deben diluir de la siguiente 

manera: 

Hasta 1000 UI/l, dilución 1:10 (por ej. 20µl de muestra + 180 µl de suero anti-HBs, negativo). 

Hasta 10.000 UI/l, dilución 1:100 (por ej. 20 µl de muestra + 180 µl de suero anti-HBs, negativo; de aquí 

20 µl + 180 µl de suero anti-HBs, negativo). 

Hasta 100.000 UI/l, dilución 1:1000 (por ej. 20 µl de muestra + 180 µl de suero anti-HBs, negativo; de aquí 

20 µl + 180 µl de suero anti-HBs, negativo; de aquí 

20 µl + 180 µl de suero anti-HBs, negativo). 

Si el procedimiento cuantitativo del test se desarrolla con una serie estandar, se deben realizar 

adicionalmente con el suero anti-HBs 100 las siguientes diluciones con suero anti-HBs, 

negativo (no es válido para la evaluación por el método-α): 

50 UI/l: dilución 1:2 (por ej. 200 µl del suero Anti-HBs 100 + 200 µl del suero de Anti-HBs, negativo) 

25 UI/l: dilución 1:4 (por ej. 150 µl del suero de 50 UI/l + 150 µl del suero Anti-HBs, negativo) 

10 UI/l: dilución 1:10 (por ej. 50 µl del suero Anti-HBs 100 + 450 µl del suero Anti-HBs, negativo) 

5 UI/l: dilución 1:20 (por ej. 150 µl del suero de 10 UI/l + 150 µl del suero Anti-HBs, negativo) 

OQNE G11 C0541 (906) H/R 47

Estabilidad y almacenaje 

Todos los componentes del envase combinado Enzygnost * Anti-HBs II aún cerrados, conservados 

a una temperatura entre +2 y +8°C, son utilizables hasta las fechas de vencimiento dadas en las 

etiquetas. 

La estabilidad y las condiciones de almacenamiento de los envases ya abiertos o de los 

reactivos ya diluidos, listos para el uso, se pueden tomar de la Tabla 1 del apéndice. 

Equipo necesario: 

BEP ® II: Para el desarrollo automático de la dosificación de reactivos y de las etapas de lavado 

BEP ® III: Para la realización completamente automática del test después de la distribución de 

las muestras, así como para la evaluación. 

BEP ® 2000: Para la realización y valoración completamente automática del test. 

Pipetas: Pipetas a émbolo 25, 100 y 1000 µl 

Incubadora: Baño de agua cubierto (+37 ± 1°C) u otros métodos de incubación similares 

Todos los instrumentos utilizados para el desarrollo del test deben estar validados. 

Material a investigar 

Para la investigación se pueden utilizar muestras aisladas (sueros humanos o plasma con 

EDTA/heparina/citrato), las cuales hayan sido tomadas según las técnicas estándar de 

laboratorio. Las muestras se pueden almacenar máximo 3 días entre 2 y 8°C. Para tiempos más 

largos de almacenamiento las muestras se deben congelar. 

Procedimiento 

Realización del test usando el BEP ® II 

1. Esquema de distribución: Determinar el número necesario de pocillos de la placa (= cantidad 

de muestras a investigar + 6 pocillos para los controles). 

2. Distribución de las muestras: 

Prueba cualitativa/Prueba cuantitativa (método - α) : 

Pipetear en cada uno de los 4 primeros pocillos (A1 hasta D1) 100 µl del suero anti-HBs, 

negativo, en el pocillo siguiente (E1) 100 µl de suero 100 anti-HBs y en cada uno de los otros 

pocillos 100 µl de la muestra. Al final de la serie o de la placa de prueba pipetear una vez más 

100 µl del suero 100 anti-HBs. 

La etapa de pipeteo debe efectuarse a buen paso dentro de un plazo máximo de 15 min. por 

placa de prueba. 

Importante: Es improcedente pipetear primero el suero 100 anti-HBs en las dos 

posiciones designadas para éste y a continuación «introducir» las muestras entre ellas. 

Prueba cuantitativa (de la serie de diluciones del estándar): 

Colocar en cada uno de 4 pocillos 100 µl de suero Anti-HBs, negativo y a continuación, en 

cada uno de 2 pocillos, 100 µl de suero Anti-HBs de las diluciones que contienen 100, 50, 25, 

10 y 5 UI/l. En cada uno de los pocillos siguientes pipetear 100 µl de la muestra 

(eventualmente, si es necesario, prediluida). 

La distribución del conjugado debe seguir inmediatamente después de la distribución de las 

muestras 

3. Distribución del conjugado: 

Agregar en cada pocillo 25 µl del conjugado HBsAg/POD (anti-HBs II). 

Cubrir con lámina adhesiva y colocar inmediatamente después de terminada la distribución 

del conjugado en el incubador. 

4. Incubación: Incubar durante 60 ± 2 min. a +37 ± 1°C; lavar de inmediato. 

5. Lavado: Retirar la lámina adhesiva, aspirar el contenido de todos los pocillos y lavar 4 veces 

usando cada vez aprox. 0,3 ml de solución de lavado. Después de terminar la fase de lavado, 

seguir inmediatamente con la siguiente dosificación de reactivos para evitar la desecación . 

6. Distribución del sustrato: Pipetear en cada pocillo 100 µl de solución de uso del cromógeno 

y cubrir la placa con una nueva lámina adhesiva. 

OQNE G11 C0541 (906) H/R 48

7. Incubación del sustrato: Incubar 30 ± 2 min. entre 15 y +25°C protegiendo de la luz. 

8. Reacción de parada: Retirar la lámina adhesiva y agregar en cada pocillo 100 µl de la 

solución de parada, manteniendo el mismo ritmo que en el punto 6. 

9. Medición: Realizar la medición en el término de una hora a 450 nm. Como longitud de onda 

de la medida de referencia se recomienda 650 (o entre 615 y 690 nm). 

Procedimiento en el BEP ® III 

Para el desarrollo del test en el BEP ® III, las placas de prueba se deben preparar hasta la 

distribución de las muestras (punto 1 hasta punto 3 del «Procedimiento en el BEP ® II»). 

Directamente después de esto, colocar las placas de prueba abiertas, esto es, sin lámina 

adhesiva en el BEP ® III. Aquí es importante observar que las placas de prueba que no estén 

llenas se deben completar con «elementos con agua» hasta por lo menos la mitad de la placa 

de prueba (6 elementos). Todas las etapas subsiguientes van a ser realizadas de forma 

completamente automática por el aparato (ver manual de funcionamiento del BEP ® III). 

Los tiempos de incubación ajustados en el software del BEP ® III pueden desviarse de los del 

procedimiento en el BEP ® II debido a condiciones técnicas básicas (ritmo del aparato), están sin 

embargo validados en la combinación BEP ® III/Enzygnost * . 

Procedimiento en el BEP ® 2000 

La distribución de las muestras y la realización subsiguiente del test se efectúa de forma completamente 

automática por el aparato (ver manual de funcionamiento del BEP ® 2000). 

Validez del test 

Los valores aislados de las extinciones de los sueros de control se van a tomar para determinar 

el valor promedio, cuando: 

-0,010 ≤ E neg. ≤ 0,120 

E suero 100 anti-HBs ≥ 0,7 

Si uno de los valores de extinción de los controles negativos, se encuentra por fuera de las 

especificaciones puede ser no tenido en cuenta. 

Los dos valores de extinción del suero 100 anti-HBs deben cumplir las especificaciones. 

Si estas condiciones no se cumplen se debe repetir el test. 

Para el test cuantitativo son válidos los siguientes criterios de validación: 

Al utilizar una serie estándar: 

E neg. ≤ E estándar 5 UI/l 

Al utilizar el método - α : 

Los valores aislados de las extinciones del suero anti-HBs 100 se van a utilizar para calcular el 

valor promedio cuando: 

límite de tolerancia inferior < E suero anti-HBs 100 < límite de tolerancia superior. 

Los valores de los límites de tolerancia inferior y superior vienen dados en la Tabla de valores 

aquí incluida. Los dos valores de extinción del suero anti-HBs 100 deben de cumplir las 

especificaciones. Además de esto, los valores aislados solamente se deben apartar del valor 

promedio en máximo un 20%. Si estas condiciones no se cumplen, el test deberá ser valorado 

sólo cualitativamente. 

Valoración del test 

La evaluación con el BEP ® 2000 y el BEP ® III, se realiza automáticamente. Para esto consultar 

los manuales de operaciones. Los siguientes capítulos son para tener en cuenta en el caso de 

evaluaciones sin la ayuda del software. 

Test cualitativo: 

Se determina el valor promedio de los valores de extinción de los controles negativos. 

Para calcular el valor límite se añade al valor promedio de los controles negativos un valor de 0,08: 

– 

E neg. + 0,08 = Valor límite (cut off) 

OQNE G11 C0541 (906) H/R 49

De acuerdo con los criterios del test las muestras a investigar se van a clasificar de la siguiente 

manera: 

1. E muestra < cut off = anti-HBs negativo 

2. E muestra ≥ cut off = anti-HBs positivo 

Test cuantitativo (método - α): 

Para cada una de las preparaciones de la placa de prueba se va a determinar un factor de 

corrección, con el cual se va a corregir cada muestra (corrección de los valores medidos). Los 

valores corregidos se van a utilizar finalmente para la determinación de la actividad de 

anticuerpo (cálculo de los resultados). 

Corrección de los valores medidos 

El factor de corrección se va a determinar de la siguiente manera: 

Valor nominal 

Factor de corrección = ––––––––––––––––––––––––––––––– 

Valor promedio del suero 100 anti-HBs 

El valor nominal viene dado en la Tabla de valores adjunta. Los valores de extinción de las 

muestras a investigar se multiplican por el factor de corrección. Los valores corregidos así 

obtenidos se van a utilizar para el cálculo de los resultados. 

En el caso de usar varias placas de prueba, se debe determinar para cada placa el factor de 

corrección, el cual se debe emplear en el cálculo de la correspondiente corrección. 

Cálculo de los resultados 

Los valores corregidos de las muestras a investigar se van a emplear en el cálculo de la 

actividad de anticuerpo de acuerdo con la siguiente fórmula (método-α): 

log 10 mUI/l = α . E β 

Las constantes α y β, dependientes del lote, se deben tomar de la Tabla de valores adjunta. El 

dato de la actividad de anticuerpo en «UI/l» se refiere a un suero HBV de referencia de la OMS. 

¡Atención!: En el cálculo no se deben utilizar: 

-Valores corregidos < cut off 

-Valores sin corregir > 2,5 

Ejemplo de corrección 

Valor calculado para α 4,8239 

Valor calculado para β 0,1054 

valor corregido de una muestra a investigar 0,950 

log 10 mUI/l (de acuerdo a la fórmula anterior) 4,7979 (véase nota 1) 

de ahí el número (en mUI/l) 62 790 (véase nota 2) 

o la actividad de anticuerpo (UI/l) 62,79 (véase nota 3) 

nota 1: Datos para la calculadora: 0,950 tecla x y , dato 0,1054, tecla =, tecla x, dato 4,8239, tecla = 

nota 2: después de la cifra obtenida anteriormente pulsar o la tecla 10 x , o las teclas INV y log. 

nota 3: Para calcular las unidades en UI/l se debe dividir el número obtenido por 1 000. 

Si la muestra a investigar estaba prediluida (por ej. 1:11), la actividad de anticuerpo (no la señal 

medida) se debe multiplicar por 11. 

Prueba cuantitativa (de la serie de diluciones del estándar): 

Para la valoración cuantitativa se calcula la media de extinción a partir de las dobles 

determinaciones de la serie de diluciones del estándar con 5, 10, 25, 50 y 100 UI/l y con estos 

valores se traza una curva de referencia sobre papel doble logarítmico. 

Abscisa: Concentración de Anti-HBs de 5 a 100 UI/l. Ordenada: Extinción de 0,05 a 2,0. En esta 

curva de referencia se leen las concentraciones de Anti-HBs en las muestras a partir de las 

respectivas extinciones. 

Si se utilizaron muestras diluidas, las concentraciones obtenidas en la curva de referencia 

deben ser multiplicadas por el factor de dilución. 

OQNE G11 C0541 (906) H/R 50

Limitaciones del Procedimiento 

1. Los anticoagulantes como heparina, EDTA y citrato no influyen sobre los resultados del test. 

2. Las muestras lipémicas, hemolíticas, las muestras que contienen factor reumatoideo y las 

muestras ictéricas no alteran el desarrollo del test. 

3. En las muestras de embarazadas no se observó ninguna influencia sobre los resultados del 

test. 

4. En el test se examinaron, además, muestras con las siguientes sustancias potencialmente 

alterantes: antígeno HBs, ANA, anticuerpos contra HCV, HAV, HBC, HBe, EBV y CMV. En 

ninguna de estas muestras se observó influencia sobre los resultados del test. 

5. No se ha observado ninguna alteración en muestras tratadas por calor (30 min. a 56 °C). 

6. No se deben emplear sueros que no estén completamente coagulados, muestras de material que 

contengan azida sódica y muestras contaminadas microbiológicamente. Si eventualmente 

existen otras partículas (por ej. coágulos de fibrina) estas deben ser separadas antes de empezar 

el test. 

7. En muestras descongeladas se debe tener en cuenta que el material se encuentre bien 

homogenizado. 

8. Los reactivos (con exepción de la solución de lavado POD, la solución de parada y la 

solución de uso del cromógeno, la cual ha sido preparada a partir de los reactivos 

dependientes del lote, cromógeno TMB y Tampón/sustrato TMB ) sólo se pueden utilizar 

juntos si provienen del mismo lote, esto es, con el mismo número de 6 cifras que está 

impreso en el envase o que se puede tomar de la Tabla do código de barras incluida en él. 

9. El tampón/sustrato TMB, la solución de uso del cromógeno y la solución de parada POD no 

deben entrar en contacto con iones de metales pesados o con sustancias oxidantes (no utilizar 

pipetas que tengan partes metálicas que entren en contacto con el líquido). Las reacciones del 

sustrato no se deben efectuar en la cercanía de medios de desinfección que contengan 

hiploclorito. Una coloración azul espontánea de la solución de uso del cromógeno antes de 

agregarse a la placa de prueba está indicando una contaminación; prepare una nueva solución en 

un recipiente limpio. Evite el contacto de la piel con las soluciones arriba mencionadas. 

10. Los sueros de control son fabricados a partir de sueros humanos nativos. Por esta razón 

puede aparecer turbidez, la cual no influye sobre los resultados del test. 

11. Durante la incubación la placa de prueba debe de permanecer en reposo (por ej. con ayuda de un 

flotador fijo o con un bañomaría no circulante). Si se utilizan agentes de conservación para evitar 

la contaminación del agua, hay que tener la precaución de que ni la superficie de la placa de 

prueba ni los pocillos entren en contacto con estas soluciones pues podrían provocar reacciones 

no especificas. 

12. En muestras altamente reactivas se puede presentar una precipitación del colorante al agregar la 

solución de parada. La valoración fotométrica de la muestra no va a ser perturbada por esto. 

13. Dade Behring ha validado el uso de los reactivos en varios analizadores para optimizar el 

rendimiento del producto y cumplir con las especificaciones del mismo. Las modificaciones 

definidas por el usuario no están garantizadas por Dade Behring dado que pueden afectar al 

rendimiento del sistema y a los resultados del ensayo. Es responsabilidad del usuario 

validar las modificaciones realizadas a estas instrucciones o el uso de los reactivos en 

analizadores distintos a los incluidos en las hojas de aplicaciones de Dade Behring o en 

estas instrucciones de uso. 

14. Los resultados de esta prueba deberán interpretarse siempre de acuerdo con la historia 

clínica del paciente, la sintomatologia clínica y otras observaciones. 

Caracteristicas del test 

Sensibilidad y especificidad 

Los resultados del control de la sensibilidad y la especificidad están resumidos en las Tablas 2 y 

3 (en el apéndice). 

Para encontrar la sensibilidad diagnóstica se investigaron 515 muestras con anti-HBs positivo y 

se hallo una sensibilidad del 100 %. La reactividad del test para muestras con seroconversión/ 

desarrollo de la vacunación se estudió en 41 casos. En esto casos se demostró que el 

Enzygnost * Anti-HBs II muestra la misma sensibilidad con relación a las muestra con 

seroconversión/desarrollo de la vacunación que otros ensayos comparables. 

OQNE G11 C0541 (906) H/R 51

La sensibilidad analítica para la valoración cuantitativa (curva estándar) se determinó en un 

preparado de referencia de la OMS con < 8 UI/l. 

Para encontrar la especificidad se investigaron en total 4736 muestras de sangre de donantes 

con anti-HBs negativo y se hallo una especificidad desde el 99,5 hasta el 99,7 %. Dependiendo, 

entre otros, del grupo colectivo a investigar, del desarrollo del test, es posible que se presenten 

desviaciones de estos valores. 

Reproducibilidad 

Los resultados de los ensayos de reproducibilidad intra/ inter están resumidos en la Tabla 4 (en 

el apéndice). En estos casos se trata de ejemplos de datos hallados. Dependiendo, entre otros, 

del desarrollo del test es posible encontrar valores que se desvíen de estos. 

* Enzygnost es una marca registrada de Dade Behring Marburg GmbH en Alemania y en otros países. 

BEP es una marca registrada de Dade Behring Marburg GmbH en USA, Alemania y en otros países. 


0197 




OQNE G11 C0541 (906) H/R 52

Tabla 1. Estabilidad y almacenaje 

Material/reactivos Estado Almacenamiento Estabilidad • 

Enzygnost * Anti-HBs II abierto entre +2 y +8°C 4 semanas 

(placa de prueba) 

en la bolsa 

con cápsulas 

deshidratantes 

Conjugado HBsAg/POD abierto entre +2 y +8°C 4 semanas 

(Anti-HBs II) 

Suero 100 anti-HBs abierto entre +2 y +8°C 4 semanas 

Suero anti-HBs, negativo < -20°C 3 meses 

Cromógeno TMB abierto entre +2 y +8°C fecha de caducidad 

Tampón/sustrato TMB abierto entre +2 y +8°C fecha de caducidad 

Solución de uso del diluida 1 + 10 entre +2 y +8°C 5 días 

cromógeno entre +15 y +25°C 8 horas 

en recipiente 

cerrado protegido 

de la luz 

Solución de lavado POD abierto entre +2 y +8°C fecha de caducidad 

(concentrado) diluida 1:20 entre +2 y +8°C 1 semana 

diluida 1:20 entre +18 y +25°C 1 día 

Solución de parada POD abierto entre +2 y +8°C fecha de caducidad 

• En ningún caso más allá de la fecha de caducidad 

Tabla 2. Sensibilidad 

Al investigar la sensibilidad usando diferentes colectivos de muestras se encontraron los 

siguientes datos: 

Numero Enzygnost * Anti-HBs II 

Colectivo de muestras de muestras positivos 

Anti-HBs positivo (Alemania) 106 106 

Anti-HBs positivo (América) 52 52 

Muestras de seguimiento 25 25 

Anti-HBs positivo 100 100 

Diferentes estados de una Infección con HBV 41 41 

Vacunados (HBV) 111 111 

Anti-HBs positivo 80 80 

Procesos de vacunación 32 casos la sensibilidad correspon- 

Seroconverción 9 casos de a la sensibilidad de otros 

métodos comparables 

Tabla 3. Especificidad 

Al investigar la especificidad usando muestras de diferentes bancos de sangre se encontraron 

los siguientes datos: 


Colectivo de muestras de muestras positivos 

Sueros negativos normales 2296 11 

Plasmas negativos normales 646 2 

Sueros negativos normales 1508 5 

Plasmas negativos normales 286 1 

OQNE G11 C0541 (906) H/R 53

Tabla 4. Reproducibilidad 

Para las investigaciones de la reproducibilidad intra-assay en dos centros independientes (K, E) 

fueron chequeadas las muestras 5 días cada una en 8 determinaciones. El cálculo del CV se 

hizo según el modelo componentes de varianza. 


Muestra Radio-Valor promedio % CV 

(K) P1 0,3 13,0 

P2 1,0 5,0 

P3 3,1 2,6 

P4 11,3 2,2 

(E) F1 0,3 9,1 

F2 1,0 4,7 

F3 4,0 3,0 

F4 9,1 4,8 

F5 14,5 5,0 

Para las investigaciones de la reproducibilidad inter-assay en dos centros independientes (K, E) 

fueron chequeadas las muestras 5 días en 8 determinaciones. El cálculo del CV se hizo según 

el modelo componentes de varianza. 


Muestra Radio-Valor promedio % CV 

(K) P1 0,3 8,3 

P2 1,0 4,1 

P3 3,1 2,3 

P4 11,3 3,6 

(E) F1 0,3 12,9 

F2 1,0 4,0 

F3 4,0 2,2 

F4 9,1 2,2 

F5 14,5 2,5 

Radio = Extinción/valor límite 

OQNE G11 C0541 (906) H/R 54

Tabla 5 Realización de la prueba y programación 

Procedimiento 



Preparación de los reactivos 

4 x 100 µl de suero control, negativo 

1 x 100 µl de suero control, positivo 

100 µl de cada muestra 

1 x 100 µl de suero control, positivo 


25 µl de fraccionadas a medias 

conjugado 

placas con "elementos 

con agua" 

60 min ± 2 min. 

(37 ± 1 °C) 

4 x lavar: BEP ® II 

100 µl de sol. de uso Procesamiento 

del cromógeno 

automático 

30 min ± 2 min. 

entre +15 °C y +25 °C 

protegido de la luz 

100 µl de sol. de 

parada 

máximo 1 h después 

Valoración a 450 nm 

(longitud de onda 

de referencia: 650 nm) 

Método-α 

Resultado de la prueba 


Programación 

para el 


BEP ® 2000 

MENU NO 

OPERATE 1 

NO 

WASHINGS 

ASPIRATE 

SOAKTIME 

DISP VOL 

CHANNEL NO 

PHOT 

OPERATE 2 

YES 

DOSIFICACIÓN DEL CONJUGADO 

WASHINGS 0 

ASPIRATE 

NO 

SOAKTIME 0 

DISP VOL 25 

CHANNEL NO 1 

PHOT 

NO 

OPERATE 3 

YES 

LAVADO E Y DOSIFICACIÓN 

DEL CHROMÓGENO 

WASHINGS 4 

ASPIRATE 

NO 

SOAKTIME 0 

DISP VOL 100 

CHANNEL NO 4 

PHOT 

NO 

OPERATE 4 

YES 

DOSIFICACIÓN SOLUCIÓN DE 

PARADA 

WASHINGS 0 

ASPIRATE 

NO 

SOAKTIME 0 

DISP VOL 100 

CHANNEL NO 5 

PHOT 

YES 

MEAS WL 450 

REF WL 650 

BLK COR 

NO 

EVAL MODE 1 

GEN CUT 

NO 

NEG CONT 4 

MAX NEG 0.120 

MIN NEG - 

FACT NEG - 

MAX POS - 

THRESH 0.08 

CUT OFF - 

OQNE G11 C0541 (906) H/R 55


Campo de aplicação 

Determinação qualitativa e quantitativa de anticorpos contra o antigénio de superfície do vírus 

da hepatite B (HBsAg) no soro e no plasma. 

O processamento do teste imunoenzimático é feito com os processadores ELISA BEP ® II, 

BEP ® III e BEP ® 2000. O teste foi desenvolvido para a análise de amostras individuais, não de 

amostras em pool. O produto só pode ser utilizado para efeitos de diagnóstico in vitro. 

Significado diagnóstico 

Tal como o antigénio de superfície do vírus da hepatite B (HBsAg), também o anticorpo anti- 

HBs, que se dirige contra a proteína de superfície, constitui um importante parâmetro diagnóstico 

numa infecção pelo vírus da hepatite B (HBV) 1, 2 . 

Durante a incubação e a fase aguda de uma infecção pelo HBV não é possível detectar 

anticorpos contra o HBsAg. Os anticorpos imunizantes anti-HBs aparecem em 90% dos casos 

só na convalescença tardia, 3 a 4 meses após o começo da doença, quando o HBsAg circulante 

já não se pode detectar 3, 4 . 

Esta seroconversão, isto é, a passagem de anti-HBs negativo a positivo, é um indicador bastante 

fiável de uma infecção HBV superada, tanto mais que também aproximadamente 10% dos 

pacientes com infecção aguda, nos quais, na fase inicial, o HBsAg é indetectável, se tornam 

mais tarde anti-HBs positivos. Assim, a comprovação de anti-HBs é também um meio adequado 

para diagnostico de infecções HBV sub-clínicas 3, 4 . 

Sendo a presença comprovada de anti-HBs indiciaidora de um contacto, no passado, com o 

antigénio, ou por infecção HBV ou por vacinação, a determinação de anti-HBs está particularmente 

indicada nas seguintes aplicações: 

a) avaliação da convalescença e, em certa medida, prognostico de infectados com HBV 

(controlo da evolução) 

b) exames serológicos no quadro de programas de vacinação (screening e controlo da 

imunização) 

c) censos epidemiológicos 

A par da detecção qualitativa, a determinação quantitativa de anti-HBs assume particular relevância 

no contexto de uma imunização activa. De acordo com uma recomendação da OMS, pode 

presumir-se uma protecção contra a infecção, na sequência de uma vacinação, quando é possível 

comprovar no soro ou no plasma uma concentração de anti-HBs > 10 UI/l. E recomendam-se 

oportunas vacinações de reforço para evitar que os valores desçam abaixo deste limiar 5, 6, 7 . 

Perante valores de anti-HBs < 100 UI/l após uma imunização básica, está indicado, de acordo 

com as recomendações da Comissão Permanente de Vacinações do Instituto Robert Koch (Alemanha)(STIKO, 

Outubro de 1995), efectuar uma revacinação no prazo de 1 ano. 

A necessidade de uma quantificação é acentuada ainda pelo facto de a duração da imunidade 

ser proporcional à concentração de anti-HBs alcançada após a vacinação. 

Princípio método 

Enzygnost * Anti-HBs II é um imunoensaio enzimático, com formação de “sandwich” de 

antigénios. HBsAg humano é utilizado como antigénio da fase sólida e como antigénio do 

conjugado. 

HBsAg marcado com peroxidase liga-se aos anticorpos específicos contra o HBs contidos na 

amostra. Estes por sua vez fixam-se aos HBsAg fixados à superfície da placa de microtitulação 

(sandwich de antigénios). 

Após eliminação, por lavagem, dos elementos não ligados, é determinada a actividade enzimática 

do conjugado. A transformação enzimática do substrato e cromogéneo (reacção cromática azul) é 

interrompida por adição da solução de paragem POD (reacção cromática amarela). A intensidade 

cromática é proporcional à concentração dos anticorpos da amostra. A quantificação é feita por 

cálculo segundo o método α ou por comparação com uma curva standard. 

OQNE G11 C0541 (906) H/R 56 

Edição Fevereiro 2004

Reagentes 

Conteúdo da embalagem comercial 


Enzygnost * Anti-HBs II 1 placa de ensaio 10 placas de ensaio 

Conjugado HBsAg/POD (Anti-HBs II) 1 x 6 ml 10 x 6 ml 

Soro Anti-HBs 100 1 x 1,5 ml 3 x 1,5 ml 

Soro Anti-HBs negativo 2 x 14 ml 5 x 14 ml 

Solução de lavagem POD (concentrado)** 1 x 100 ml 2 x 100 ml 

Tampão-substrato TMB** 1 x 30 ml 4 x 30 ml 

Cromogéneo TMB** 1 x 3 ml 4 x 3 ml 

Solução de paragem POD** 1 x 100 ml 2 x 100 ml 

Frasco vazio para a solução de trabalho do cromogéneo 1 unidade 1 unidade 

Folhas adesivas 6 unidades 24 unidades 

Bolsa de PE 1 unidade 1 unidade 

Tabela de código de barras 1 unidade 1 unidade 

Folheto da embalagem 1 unidade 1 unidade 

Outras embalagens comerciais: 100 x 96 

** Estes componentes também são uma parte integrante da embalagem dos reagentes acidionais 

para Enzygnost* TMB (ref. OUVP). 

Composição 

Enzygnost * Anti-HBs II (Placa de ensaio): Placa de microtitulação revestida com HBsAg 

inactivado (subtipos ad e ay), isolado de sangue humano. 

Conjugado HBsAg/POD (Anti-HBs II): HBsAg inactivado de sangue humano, conjugado com 

peroxidase (POD), Tris (aprox. 100 g/l), NaCl (aprox. 47 g/l). 

Conservante: fenol (máx. 1 g/l) 

Soro Anti-HBs 100: Soro humano anti-HBs inactivado (concentração nominal 100 ± 25 UI/l), 

calibrado em concordância com o preparado de referência da OMS. Valor indicativo de 

absorvância: ≥ 0,7. 

Conservantes: anfotericina (aprox. 5 mg/l) 

gentamicina (aprox. 100 mg/l) 

Soro Anti-HBs negativo: Soro humano; valor indicativo de absorvância: ≤ 0,12 

Conservantes: anfotericina (aprox. 5 mg/l) 

gentamicina (aprox. 100 mg/l) 

Solução de lavagem POD (concentrado): Tampão de fosfato com Tween (90 mmol/l) 

Conservante: fenol (máx. 1 g/l) 

Tampão/substrato TMB: Peróxido de hidrogénio (aprox. 0,1 g/l) em tampão de acetato (25 

mmol/l) 

Conservante: n-butanol (máx. 10 ml/l) 

Cromogéneo TMB: Dihidrocloreto de tetrametilbenzidina (5 g/l) 

Solução de paragem POD: Ácido sulfúrico 0,5 N 

OQNE G11 C0541 (906) H/R 57

Advertências e medidas de precaução 

1. Só para uso diagnóstico in vitro 

2. Cada dádiva individual de sangue destinada à preparação dos soros de controlo de 

Enzygnost * Anti-HBs II foi previamente examinada com vista à detecção de HBsAg, anti- 

HCV, anti-HIV1 e anti-HIV2. Na elaboração só são utilizadas dádivas com resultado negativo. 

No entanto, todos os materiais obtidos de sangue humano devem ser manuseados com as 

precauções devidas, seguindo as medidas de segurança recomendadas em caso de risco 

biológico, uma vez que nunca se pode excluir inteiramente o risco de contaminação por 

agentes patogénicos 8 . 

3. O HBsAg utilizado na preparação das placas de teste e do conjugado POD foi isolado, com 

um alto grau de pureza, de plasmas humanos positivos relativamente ao HBsAg e negativos 

com relação ao anti-HCV, ao anti-HIV1 e ao anti-HIV2, e submetido a um reconhecido 

processo de inactivação. 

4. Recomenda-se utilizar luvas para análise durante toda a realização do teste. 

5. Para descontaminação de materiais sólidos, aconselha-se uma autoclavagem durante pelo 

menos 1 hora a uma temperatura de, pelo menos, + 121° C. Todas as soluções aspiradas 

devem ser recolhidas em dois recipientes ligados em série, os quais devem conter um 

desinfectante apropriado para inactivação de vírus humano-patogénicos. Observem-se as 

concentrações e os tempos de incubação indicados pelo fabricante. 

Preparação dos reagentes 

Antes de iniciar o teste, levar todos os reagentes e amostras à temperatura de + 15 a + 25° C, 

mas sem tirar a placa de ensaio do seu recipiente. 

Retirar do suporte os conjuntos de poços desnecessários e reservá-los para posterior utilização 

(cf. Tabela 1). 

Para cada placa de ensaio, diluir 20 ml da solução de lavagem POD (concentrado) com água 

destilada ou desionizada até obter 400 ml. 

Diluir, por placa, 1 ml de cromogéneo TMB com 10 ml de tampão/substrato TMB no frasco 

de plástico anexo à embalagem (solução de trabalho do cromogéneo) e conservá-lo fechado e 

ao abrigo da luz. Depois do uso, lavá-lo cuidadosamente com água destilada. 

Dada a capacidade dos frascos, não passar todo o conteúdo do frasco de cromogéneo TMB 

para o de tampão/substrato TMB. 

Pré-diluição das amostras: No teste quantitativo, e para concentrações previstas de anti- 

HBs ≥ 100 UI/l, as amostras devem ser diluídas como segue: 

Até 1000 UI/l: diluição 1 : 10 (p. ex. 20 µl de amostra + 180 µl de soro anti-HBs negativo) 

Até 10.000 UI/l: diluição 1 : 100 (p. ex. 20 µl de amostra + 180 µl de soro anti-HBs negativo; 

e, de aí, 20 µl + 180 µl de soro anti-HBs negativo) 

Até 100.000 UI/l: diluição 1 : 1000 (p. ex. 20 µl de amostra + 180 µl de soro anti-HBs negativo; 

desta diluição 20 µl + 180 µl de soro anti-HBs negativo; e, 

desta, 20 µl + 180 µl de soro anti-HBs negativo). 

Se a realização quantitativa do teste é feita a partir duma série standard, é necessário preparar, 

com soro anti-HBs negativo, as diluições complementares seguintes do soro anti-HBs 100 (mas 

não no caso de uma avaliação pelo método α ): 

50 UI/l: diluição 1 : 2 (p. ex. 200 µl de soro anti-HBs 100 + 200 µl de soro anti-HBs negativo) 

25 UI/l: diluição 1 : 4 (p. ex. 150 µl do soro de 50 UI/l + 150 µl de soro anti-HBs negativo) 

10 UI/l: diluição 1 : 10 (p. ex. 50 µl do soro anti-HBs 100 + 450 µl de soro anti-HBs negativo 

5 UI/l: diluição 1 : 20: (p. ex. 150 µl do soro de 10 UI/l + 150 µl de soro anti-HBs negativo) 

Estabilidade e condições de conservação 

Antes de abertos, e enquanto conservados entre +2 e +8° C, todos os componentes da 

embalagem combinada Enzygnost * Anti-HBs II se mantêm utilizáveis até às datas indicadas nos 

rótulos. 

Sobre estabilidade e condições de conservação dos reagentes abertos ou diluídos para uso, v. 

tabela 1 em apêndice. 

OQNE G11 C0541 (906) H/R 58

Aparelhos necessários 

BEP ® II: para a execução automática da dosagem dos reagentes e das fases de lavagem 

BEP ® III: Processamento automático do ensaio e interpretação após dosagem das 

amostras 

BEP ® 2000: para o processamento e interpretação do teste, de forma inteiramente 

automática. 

Pipetas: pipetas com êmbolo 25, 100 e 1000 µl 

Incubador: Banho-maria tapado (+37 ± 1 °C) ou outros métodos de incubação comparáveis 

Todos os aparelhos utilizados no ensaio têm de estar validados. 

Amostras 

Para a análise podem ser utilizadas amostras individuais (soros humanos e plasmas EDTA/ 

Heparina/Citrato), colhidos de acordo com as técnicas do laboratório. As amostras poderão ser 

conservadas durante de 3 dias, no máximo, entre 2 - 8 °C. Se pretender conservá-las durante 

um período de tempo superior, deverão ser congeladas. 

Procedimento 

Realização do teste com o BEP ® II 

1. Esquema de distribuição: Determinar o número necessário de poços (= número das 

amostras a investigar + 6 poços para os controlos). 

2. Distribuição das amostras 

Teste qualitativo / Teste quantitativo (Método α) 

Distribuir em cada um de 4 poços (A1 a D1) 100 µl de soro anti-HBs negativo; em 1 poço (E1) 

100 µl de soro anti-HBs 100; em cada um dos poços seguintes 100 µl de amostra; e no fim da 

série, ou da placa, novamente 100 µl de soro anti-HBs 100. 

A distribuição tem de ser feita num máximo de 15 minutos por placa. 

Importante: 

Não é permitido distribuir primeiro o soro anti-HBs 100 nas duas posições previstas e só 

depois as amostras entre elas. 

Teste quantitativo (série standard): 

Distribuir em 4 poços 100 µl, em cada um, de soro anti-HBs negativo, e a seguir em 2 poços 100 

µl, em cada um, das diluições do soro anti-HBs correspondentes a 100, 50, 25, 10 e 5 UI/l. Nos 

poços seguintes distribuir 100 µl, em cada um, de amostra (eventualmente pré-diluída). 

Terminada a distribuição das amostras, iniciar imediatamente a distribuição do conjugado. 

3. Distribuição do conjugado: Distribuir em cada poço 25 µl de conjugado HBsAg/POD (Anti- 

HBs II). A seguir, cobrir com folha adesiva e colocar a placa imediatamente na incubadora. 

4. Incubação: Deixar incubar durante 60 ± 2 min. a + 37 ± 1° C, imediatamente a seguir dar 

início à lavagem. 

5. Lavagem: Retirar a folha adesiva, aspirar o conteúdo de todos os poços e lavar cada um 4 

vezes com aprox. 0,3 ml, de cada vez, de solução de lavagem. Depois das operações de 

lavagem passar imediatamente à distribuição do substrato para evitar uma dessecação. 

6. Distribuição do substrato: Distribuir 100 µl de solução de trabalho de cromogéneo em cada 

poço, cobrir a placa com nova folha adesiva. 

7. Incubação do substrato: Deixar incubar durante 30 ± 2 min ao abrigo da luz entre + 15 e + 25° C. 

8. Reacção de paragem: Retirar a folha adesiva. Acrescentar a cada poço 100 µl de solução 

de paragem POD, mantendo o mesmo ritmo que em 6. 

9. Leitura: Fazer uma medição fotométrica a 450 nm dentro de 1 hora. Como comprimento de 

onda de referência aconselha-se 650 nm (eventualmente entre 615 e 690 nm). 

OQNE G11 C0541 (906) H/R 59

Realização do teste com o BEP ® III 

No caso do processamento ser feito com BEP ® III é necessário preparar as placas de ensaio 

incluindo a dosagem das amostras (ponto 1 e 2 da “execução do teste com BEP ® II"). 

Imediatamente a seguir, as placas de ensaio são colocadas no BEP ® III abertas, ou seja, sem 

película colada. Ao mesmo tempo, é necessário prestar atenção a que as placas de ensaio 

parcialmente providas de ”barras de água” sejam acrescentadas até ficarem, no mínimo, pelo 

meio ( 6 barras de água). O processamento subsequente do teste realiza-se automaticamente 

(vide instruções de serviço do BEP ® III). 

Devido às condições técnicas básicas (ciclo dos aparelhos), os tempos de incubação ajustados 

no software do BEP ® III podem divergir dos tempos do processamento com o BEP ® II, mas 

foram validados na combinação BEP ® III/Enzygnost * . 

Realização do teste com o BEP ® 2000 

A dosagem das amostras e subsequente processamento do teste são efectuados de forma 

totalmente automática no aparelho (vide instruções de serviço do BEP ® 2000). 

Validação do teste 

Os valores de absorvância dos soros de controlo serão utilizados para cálculo dos valores médios, se: 

- 0,010 ≤ E neg. ≤ 0,120 

E soro anti-HBs 100 ≥ 0,7 

Dos valores de absorvância dos controlos negativos, caso exista um fora da especificação poderá 

ser ignorado. Os valores de absorvância do soro standard anti-HBs 100 têm de corresponder 

ambos às especificações. Não estando preenchidas estas condições, há que repetir o teste. 

Para o teste quantitativo, os critérios de validação são os seguintes: 

Com uma série standard: 

E neg ≤ E standard 5 UI/l 

Com o método α: 

Os valores de absorvância dos soros de controlo serão utilizados para cálculo dos valores médios, se: 

limite inferior < E soro anti-HBs 100 < limite superior 

Os valores dos limites inferior e superior vêm indicados na tabela de valores adjunta. 

Os valores de absorvância do soro anti-HBs 100 têm de corresponder ambos à especificação. 

Além disso, a margem de variação de cada valor não pode ir além de 20% relativamente à 

média destes dois valores. 

Não estando preenchidas estas condições, o teste só pode ser valorado qualitativamente. 

Cálculo de Resultados 

As interpretações são realizadas automaticamente com o BEP ® 2000 e BEP ® III. Para o efeito, 

consultar as instruções de serviço. Para uma interpretação sem a ajuda do software, é 

necessário prestar atenção aos seguintes capítulos. 

Teste qualitativo: 

Calcular a média dos valores de absorvância dos controlos negativos. 

Para calcular o valor-limite, adicionar 0,08 ao valor médio de absorvância dos controlos 

negativos: 

– 

E neg. + 0,08 = valor-limite (cut off) 

De acordo com os critérios do teste, as amostras serão classificadas do seguinte modo: 

1. E amostra < cut off = anti-HBs negativo 

2. E amostra ≥ cut off = anti-HBs positivo 

OQNE G11 C0541 (906) H/R 60

Teste quantitativo (método α): 

É determinado para cada placa um factor de correcção com o qual se corrige o valor de 

absorvância obtido para cada amostra (correcção dos valores medidos). Com base nesses 

valores corrigidos é feito então o cálculo da concentração de anticorpos (cálculo dos 

resultados). 

Correcção dos valores medidos 

O factor de correcção é determinado segundo a fórmula seguinte: 

valor nominal 

factor de correcção = –––––––––––––––––––––––––– 

valor médio do soro anti-HBs 100 

O valor nominal vem indicado na tabela de valores adjunta à embalagem. Os valores de 

absorvância das amostras são multiplicados pelo factor de correcção. Os valores corrigidos 

assim obtidos são depois utilizados para o cálculo dos resultados. 

Para cada placa, determinar o factor de correcção e utilizá-lo para o respectivo cálculo de 

correcção. 

Cálculo dos resultados 

Para calcular a concentração de anticorpos, utilizar a fórmula seguinte com base nos valores 

corrigidos das amostras (método α): 

log 10 mUI/l = α • E β 

As constantes α e β, que variam segundo os lotes, vêm indicadas na tabela de valores adjunta. 

A concentração de anticorpos, expressa em "UI/l", refere-se ao soro de referência HBV 

internacional da OMS. 

Atenção: Não utilizar para o cálculo: 

- valores corrigidos < cut off 

- valores não corrigidos > 2,5 

Exemplo de cálculo 

Valor de cálculo para α 4,8239 

Valor de cálculo para β 0,1054 

valor corrigido duma amostra 0,950 

log 10 mUI/l (segundo fórmula acima) 4,7979 (v. nota 1) 

daí o antilogaritmo (em mUI/l) 62 790 (v. nota 2) 

ou concentração de anticorpos (UI/l) 62,79 (v. nota 3) 

nota 1: Dados para a calculadora: 0,950 tecla x y , digitar 0,1054, tecla =, tecla x, digitar 4,8239, 

tecla = 

nota 2: depois do número obtido, premir a tecla 10 x ou as teclas INV e log 

nota 3: para converter em UI/l, dividir o número obtido por 1000. 

Se a amostra estava pré-diluída (p. ex. a 1:11), multiplicar a concentração de anticorpos (não o 

sinal de medida) por 11. 

Teste quantitativo (série standard) 

Para a leitura quantitativa, calcular os valores médios de absorvância das duplas determinações 

da série de diluições standard de 5, 10, 25, 50 e 100 UI/l e, com estes valores, traçar uma curva 

de referência sobre papel bilogarítmico. Abcissa: concentração de anti-HBs de 5 a 100 UI/l. 

Ordenada: absorvância 0,05 a 2,0. As concentrações de anti-HBs das amostras lêem-se desta 

curva com base em cada um dos valores de absorvância. 

Se as amostras foram diluídas, multiplicar a concentração lida na curva pelo factor de diluição. 

OQNE G11 C0541 (906) H/R 61

Limitações do procedimento 

1. Anticoagulantes como heparina, EDTA e citrato não influenciam o resultado do teste. 

2. Amostras lipémicas, hemolíticas, ictéricas ou que contenham factor reumatóide não prejudicam 

o teste. 

3. Com amostras de mulheres grávidas não foi observada qualquer influência sobre o 

resultado do teste. 

4. Com o teste foram examinadas amostras com as seguintes substâncias potencialmente 

perturbadoras: Antigénio HBs, ANA e anticorpos contra HCV, HAV, HBC, HBe, EBV e CMV. 

Com as amostras usadas não foi observada qualquer influência sobre o resultado do teste. 

5. Não foram observadas alterações em amostras sujeitas a tratamento térmico (30 min, 56° C). 

6. Não empregar soros coagulados, com azida sódica ou contaminados. Partículas 

eventualmente existentes (p. ex. coágulos de fibrina) devem ser previamente retiradas. 

7. Amostras descongeladas devem estar bem homogeneizadas. 

8. Os reagentes (com excepção da solução de lavagem POD, da solução de interrupção POD e 

da solução de trabalho do cromogénio, preparada esta última a partir dos reagentes 

específicos de cada lote Cromogénio TMB e Tampão/substrato TMB) só podem ser utilizados 

como constituintes de um mesmo lote, isto é, somente na combinação de 6 cifras que vem 

impressa na embalagem e indicada na Tabela de código de barras adjunta. 

9. O tampão/substrato TMB, a solução de trabalho do cromogénio e a solução de paragem POD 

não devem entrar em contacto com iões de metais pesados nem com substâncias oxidantes 

(não usar pipetas com partes metálicas portadoras de líquido). Não efectuar a reacção do 

substrato na proximidade de desinfectantes que contenham hipoclorito. Uma coloração azul 

espontânea da solução de trabalho do cromogéneo antes de esta ser colocada na placa de 

ensaio é indício de contaminação; deverá então preparar-se uma solução fresca num 

recipiente limpo. Evite-se o contacto cutâneo com as soluções acima mencionadas. 

10. Os soros de controlo são preparados utilizando soros humanos congénitos. Por essa razão, 

podem ocorrer turvações que, todavia, não influenciam o resultado do teste. 

11. Durante a incubação deve manter-se a placa de ensaio imóvel (p. ex. sobre um suporte fixo 

ou num banho-maria sem circulação de água); deste modo as cavidades mantêm-se em 

contacto com a água temperada. Caso se utilizem estabilizadores para evitar uma 

contaminação da água, tomar todo o cuidado para que nem a superfície da placa de ensaio 

nem os receptáculos entrem em contacto com estas soluções, pois tais contaminações 

podem produzir reacções inespecíficas. 

12. Em amostras altamente reactivas o corante pode precipitar ao adicionar-se a solução de 

paragem. O facto é irrelevante para os resultados fotométricos. 

13. A Dade Behring validou a utilização destes reagentes em vários analisadores, com o intuito 

de optimizar o desempenho do produto e satisfazer as especificações do produto. As 

modificações definidas pelo utilizador não são suportadas pela Dade Behring, na medida 

em que podem afectar o desempenho do sistema e os resultados do ensaio. Constitui 

responsabilidade do utilizador validar as modificações efectuadas nestas instruções ou em 

relação ao uso dos reagentes noutros analisadores que não os incluídos nas folhas de 

instruções de aplicação da Dade Behring ou nestas instruções de utilização. 

14. Os resultados deste teste devem sempre ser interpretados em conjunto com o histórico 

médico do doente, estado clínico e outros dados de interesse. 

OQNE G11 C0541 (906) H/R 62

Características do teste 

Sensibilidade e especificidade 

Os resultados das provas de sensibilidade e especificidade encontram-se resumidos nas 

tabelas 2 + 3 (em anexo). 

Para averiguar a sensibilidade diagnóstica foi investigado um total de 515 amostras anti-HBs 

positivas, tendo sido verificada uma sensibilidade de 100%. A reactividade ao ensaio 

relativamente a amostras em seroconversão ou após vacinação foi testada em 41 casos. Pôde 

observar-se que o Enzygnost * Anti-HBs II apresenta, no que diz respeito ao reconhecimento de 

seroconversões ou de evoluções de vacinação, um grau de sensibilidade equivalente à de 

métodos similares. 

A sensibilidade analítica foi determinada com a avalização quantitativa (curva standard) do 

preparado de referência da WHO com < 8 UI/l. 

Para determinação da especificidade foi testado um total de 4.736 amostras de sangue anti-HBs 

negativas, tendo sido achada uma especificidade de 99,5 a 99,7%. Estes valores podem variar 

em função da amostragem sujeita a teste, da modalidade de execução do teste ou de outros 

factores. 

Reprodutibilidade 

Os resultados para a reprodutibilidade em intra/inter-ensaio estão resumidos na Tabela 4 (em 

apêndice). Estes dados devem ser compreendidos somente a título de exemplo. Eles podem 

variar em função da modalidade de execução do teste ou de outros factores. 

* Enzygnost e uma marca registada da Dade Behring Marburg GmbH na Alemanha e noutros países. 

BEP e uma marca registada da Dade Behring Marburg GmbH nos EUA, na Alemanha e noutros 

países. 


0197 




OQNE G11 C0541 (906) H/R 63

Tab. 1 Estabilidade e condições de conservação 

Material/Reagente Estado Conservação Estabilidade • 

Enzygnost * Anti-HBs II aberto +2 a +8° C 4 semanas 

(Placa de ensaio) 

na bolsa com 

cápsulas 

dessecantes 

Conjugado HBsAg/POD (Anti-HBs II) aberto + 2 a + 8° C 4 semanas 

Soro Anti-HBs 100 aberto + 2 a + 8° C 4 semanas 

Soro Anti-HBs negativo < - 20° C 3 meses 

Cromogéneo TMB aberto + 2 a + 8° C até termo da validade 

Tampão/Substrato TMB aberto + 2 a + 8° C até termo da validade 

Solução de trabalho do cromogéneo diluída + 2 a + 8° C 5 dias 

1 + 10 +15 a +25° C 8 horas 

recipiente fechado, 

ao abrigo da luz 

Solução de lavagem POD aberta + 2 a + 8° C até termo da validade 

(concentrado) diluída 1 : 20 + 2 a + 8° C 1 semana 

diluída 1 : 20 +18 a +25° C 1 dia 

Solução de paragem POD aberta + 2 a + 8° C até termo da validade 

• Nunca além do prazo de validade! 

Tab. 2 Sensibilidade 

Nos exames de sensibilidade com base em diferentes colectivos de amostras, foram 

determinados os seguintes dados: 


Colectivos de amostras de amostras positivos 

Anti-HBs positivos (Alemanha) 106 106 

Anti-HBs positivos (América) 52 52 

amostras de controlo da evolução 25 25 

Anti-HBs positivos 100 100 

Diferentes estádios de uma infecção com HBV 41 41 

Vacinados (HBV) 111 111 

Anti-HBs positivos 80 80 

Processos de vacinação 32 casos sensibilidade equivalente 

Seroconversão 9 casos à de métodos similares 

Tab. 3 Especificidade 

Nos exames de especificidade com base em amostras de bancos de sangue diferentes, foram 

determinados os seguintes dados: 


Colectivos de amostras de amostras positivos 

Soros negativos normais 2296 11 

Plasmas negativos normais 646 2 

Soros negativos normais 1508 5 

Plasmas negativos normais 286 1 

OQNE G11 C0541 (906) H/R 64

Tab. 4 Reprodutibilidade 

Resultados do exame da reprodutibilidade intra-ensaio realizado em 2 centros independentes 

(K, E) e em que as amostras foram testadas 8 vezes em 5 dias diferentes. O cálculo CV foi feito 

por análise dos componentes da variação. 


Amostra Razão média % CV 

(K) P1 0,3 13,0 

P2 1,0 5,0 

P3 3,1 2,6 

P4 11,3 2,2 

(E) F1 0,3 9,1 

F2 1,0 4,7 

F3 4,0 3,0 

F4 9,1 4,8 

F5 14,5 5,0 

Resultados do exame da reprodutibilidade inter-ensaio realizado em 2 centros independentes 

(K, E) e em que as amostras foram testadas 8 vezes em 5 dias diferentes. O cálculo CV foi feito 

por análise dos componentes da variação. 


Amostra Razão média % CV 

(K) P1 0,3 8,3 

P2 1,0 4,1 

P3 3,1 2,3 

P4 11,3 3,6 

(E) F1 0,3 12,9 

F2 1,0 4,0 

F3 4,0 2,2 

F4 9,1 2,2 

F5 14,5 2,5 

Razão = absorvância/valor-limite 

OQNE G11 C0541 (906) H/R 65

Tab. 5 Realização e programação do ensaio 

Realização 


60 min ± 2 min. 

(37 ± 1 °C) 

BEP ® II: lavar 4 x 

Preparação dos reagentes 

100 µl solução de trabalho Processamento 

do cromogéneo 

automático 

30 min ± 2 min. 

+15 °C a +25 °C 

ao abrigo da luz 

100 µl de solução 

de paragem 

após máx. 1 h 

Leitura a 450 nm 

(comprimento de onda 

de referência: 650 nm) 

Método-α 


Resultado do teste 

Programação do 

Menu para o 


BEP ® 2000 

4 x 100 µl de soro de controlo negativo 

1 x 100 µl de soro de controlo positivo 

MENU NO 

OPERATE 1 

NO 

100 µl de cada amostra não diluída 

WASHINGS 

1 x 100 µl de soro de controlo positivo 

ASPIRATE 

SOAKTIME 

DISP VOL 


BEP ® III CHANNEL NO 

PHOT 

OPERATE 2 

YES 

DOSAGEM DO CONJUGADO 

25 µl de placas incompletas: WASHINGS 0 

conjugado 

completar até meia placa com 

fileiras de poços com água ASPIRATE 

NO 

SOAKTIME 0 

DISP VOL 25 

CHANNEL NO 1 

PHOT 

NO 

OPERATE 3 

YES 

LAVAGEM E DOSAGEM DO 

CROMOGÉNEO 

WASHINGS 4 

ASPIRATE 

NO 

SOAKTIME 0 

DISP VOL 100 

CHANNEL NO 4 

PHOT 

NO 

OPERATE 4 

YES 

DOSAGEM DA SOLUÇÃO DE 

BLOQUEIO 

WASHINGS 0 

ASPIRATE 

NO 

SOAKTIME 0 

DISP VOL 100 

CHANNEL NO 5 

PHOT 

YES 

MEAS WL 450 

REF WL 650 

BLK COR 

NO 

EVAL MODE 1 

GEN CUT 

NO 

NEG CONT 4 

MAX NEG 0.120 

MIN NEG - 

FACT NEG - 

MAX POS - 

THRESH 0.08 

CUT OFF - 

OQNE G11 C0541 (906) H/R 66

Bibliography/Literatur/Littérature/Bibliagrafia/Bibliografía/Bibliografia 

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HHS Publication (CDC) 93-8395; 1999; Section II; 8-16. 

Symbols Key / Symbolschlüssel / Explication des Symboles / 

Interpretazione simboli / Clave de los Símbolos / Chave dos Símbolos 

Manufactured by / Hergestellt von / Fabriqué par / Prodotto da / Fabricado por 

IVD 

LOT 

EXP 

CCYY-MM-DD 

In Vitro Diagnostic Medical Device / In Vitro Diagnosticum / Dispositif Médical 

Diagnostic In Vitro / Dispositivo Medico per Diagnostica In Vitro / Producto sanitario 

para Diagnóstico In Vitro 

Lot Number / Chargenbezeichnung / Numéro de Lot / Numero di Lotto / Número de 

Lote 

Expiration Date / Verfalldatum / Date de Péremtion / data di scadenza / Fecha de 

vencimiento / termo da validade 

Storage Temperature / Lagertemperatur / Température de Conservation / Temperatura 

di conservazione / Temperatura de almacenamiento / Temperatura de armazenagem 

REF 

CE Mark / CE-Zeichen / Marquage CE / Marchio CE / CE Marca / Marca CE 

Catalogue Number / Katalog Nummer / Référence / Codice Catalogo / Número de 

Catálogo 

Consult Instructions for Use / Gebrauchsanweisung beachten / Consulter la Notice 

d'Utilisation / Istruzioni per l'uso / Consultar Instucciones para el Uso / Consulte as 

Instruções de Utilização 

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Enzygnost* Anti-HBs II - Medcorp

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