Mecanismos de transporte de nitrato, amonio y fosfato y ...

Lourdes Rubio II. Material y Métodos
De la misma forma que en el caso de la medida de pH citoplasmático, la
señal eléctrica de cada una de las barras del microelectrodo selectivo para Na + se
transmite al registrador, en el que simultáneamente se recogen las medidas de cada
una de las sondas (sonda A y sonda B), así como la diferencia entre las dos (A –
B), a partir de la cual se obtiene el valor de actividad de Na + de la solución en
contacto con el microelectrodo. El potencial de punta del microelectrodo de Na +
viene determinado por el potencial eléctrico generado por la diferencia de
concentración de Na + entre el medio y el electrolito (500 mM NaCl).
Las medidas de concentración citoplasmática de Na + se desarrollaron en
células epidérmicas de la raíz y del mesófilo foliar, utilizando el mismo sistema
descrito para la medida de E m y pH citoplasmático (apartado II.2.1).
La actividad citoplasmática de Na + se calculó multiplicando el valor de
concentración citoplasmática obtenido por el coeficiente de actividad de Na + ().
Dicho coeficiente se obtuvo a partir de la pendiente del ajuste lineal de la
actividad iónica correspondiente a cada concentración de Na + presente en las
soluciones de calibración de los microelectrodos.
II.3 Aislamiento y purificación de vesículas de plasmalema
La membrana plasmática presenta unas características superficiales que la
diferencian del resto de membranas intracelulares y le confieren una extremada
adsorción al polietilen-glicol (Albertsson, 1971). Así, suelen ser purificadas por
separación de fases con mayor rendimiento que por centrifugación en gradiente de
densidad (Widell y Larsson, 1981; Lundborg et al., 1981; Larsson, 1984). El
método de reparto en dos fases (dextrano y polietilenglicol) garantiza el
aislamiento de la membrana plasmática, sellada en forma de vesículas con la cara
citoplasmática hacia el exterior, sin demasiada contaminación con otras
membranas intracelulares; además, es un método rápido (Larsson, 1984).
El sistema de reparto en dos fases separadas se fundamenta en la mezcla de
disoluciones acuosas de dos polímeros, dextrano y polietilenglicol (PEG). La
formación de dos fases separadas viene determinada por la proporción de peso de
ambos polímeros y es extremadamente dependiente de la temperatura,
produciéndose la mezcla de las dos fases por encima de los 4 ºC. La fase superior
está enriquecida en PEG, mientras que el dextrano se concentra en la fase inferior.
57