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cabra anti-IgG de coelho conjugado com isotiocianato de tetrametilrodamina (1:250
em PBS, Sigma) durante 30 min à temperatura ambiente. A cromatina nuclear das
células fixadas foram coradas com o corante fluorescente DAPI, a uma
concentração final de 5 µg/mL em PBS, durante 10 min à temperatura ambiente em
câmara escura. Em seguida, as células foram analisadas por microscopia de
fluorescência (Olympus BX70) e fotografadas utilizando uma câmara digital (CE
Roper Scientific).
Para identificar microglia ativada em células fixadas foi realizada
imunocitoquímica para OX-42 (CD11b) antes da coloração de Rosenfeld. Primeiro, a
atividade da peroxidase endógena foi bloqueada durante 10 minutos com peróxido
de hidrogênio a 3%. A co-cultura foi incubada durante 1 h com o anticorpo
monoclonal de camundongo anti OX-42 (CD11b/c (1:200), Caltag, Burlingame, CA).
As células foram então incubadas com anticorpo de cabra anti-IgG de camundongo
conjugado com peroxidase (1:1000, Sigma) durante 1 h. As células microgliais foram
identificadas pela cor castanho após a incubação com o substrato, 0,3% de 4-Cl-
alfanaftol/solução de metanol diluído em tampão PBS (1:5) mais H2O2 (0,33 mL/mL),
à temperatura ambiente durante 30 min. E após coloração de Rosenfeld as mesmas
foram identificadas com uma cor preta. Estas células foram analisadas (Olympus
BX70) e fotografadas (CE Roper Scientific) num microscópio de fase óptica de luz
utilizando uma câmara digital. O número de células imunorreactivas foram contadas
sob o microscópio usando 20X de ampliação num campo 0,29 mm 2 . Dez campos
representativos aleatorizados foram analisados, e a proporção de células OX-42-
positivas foi apresentada como a percentagem de células marcadas entre o número
total de células contadas.
Ensaio de proteína e western blot
A expressão de GFAP foi investigada por Western blot e imunodetecção.
Após o tratamento, as células foram lavadas duas vezes com PBS, lisadas e
coletadas em 2% (peso/volume) de SDS, 2 mmol/L de EGTA, 4 mol/L de ureia, 0,5%
(v/v) de Triton X-100, e 62,5 mmol/L Tris-HCl (pH 6,8) suplementado com 0,1% (v/v)
de um coquetel de inibidores de protease (Sigma). O teor de proteína total foi
determinado através de um método de LOWRY et al. (1951) adaptado em kit de
reagente de proteína (Bio-Rad, Hercules, CA, EUA). Para este ensaio, 50 µg de
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