IdentificaÃ§Ã£o do efeito antitumoral de um polipeptÃdeo isolado da ...

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5.4.2. Cromatografia de troca aniônica em coluna DEAE CeluloseA fração FIII, com atividade gelatinolítica intensa foi submetida à cromatografia detroca aniônica em coluna de DEAE-Celulose. Três grupos de proteínas foram obtidos edenominados de acordo com a concentração de sal necessária para sua eluição (FIII100,FIII200 e FIII400). A FIG.28 mostra o perfil obtido neste processo cromatográfico. Aatividade gelatinolítica predominante estava associada à fração FIII200 (FIG.29), a qualfoi utilizada para dar continuidade ao processo de purificação.1,2FIII 2000,41A 280nm0,80,60,4FIII 3000,30,2[ NaCl ] M (-----)0,10,2FIII 10001 9 17 25 33 41 49 57 65 73 80 88Tubos0FIG.28: Perfil cromatográfico da troca aniônica da fração FIII. Coluna de troca aniônica(DEAE Celulose, 1,0 x 10cm). A coluna foi equilibrada e eluída com tampão fosfato 10mM pH7,6, a 4°C e as proteínas foram eluídas com um gradiente “step-wise” de NaCl (0; 0,1; 0,2 e0,4M). O fluxo foi de ~1,5ml/min com frações de 1,5ml/tubo. O conteúdo protéico do eluato foiestimado pela leitura da absorbância a 280nm. As abreviações FIII100, FIII200 e FIII400correspondem às frações agrupadas.106
FIG.29: Zimograma das frações obtidas da segunda etapa de purificação cromatográfica.O zimograma em detalhe mostra a atividade gelatinolítica das frações (~5µg) (A) FIII100, (B)FIII200 e (C) FIII400, utilizando gel 7,5% de acrilamida em Tris- HCl pH 8,8 contendo 0,1% degelatina. Após remoção do SDS do gel com Triton X-100, este foi incubado em tampão fosfato0,1M pH 7,5 por 16h a 37°C. O gel foi revelado com azul de coomassie. A fração FIII200 foiselecionada para dar continuidade ao processo de purificação.5.4.3. Cromatografia em Coluna de Fase Reversa C4Nesta etapa, a fração FIII200 foi submetida à cromatografia de fase reversa em HPLCutilizando coluna analítica Supelco C4. Neste processo foram obtidos três picosprincipais, dois durante o gradiente de ACN (denominados FIII200/1 e FIII200/2), e umeluído à 100% de ACN (denominado FIII200/3) (FIG.30). Os três picos foram testadosquanto à presença de atividade gelatinolítica, sendo FIII200/2, eluído comaproximadamente 39% de ACN, o único a apresentar tal atividade (FIG.31).107
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