IdentificaÃ§Ã£o do efeito antitumoral de um polipeptÃdeo isolado da ...

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intraperitoneais de 0,2mL de fluido ascítico recém extraído de um camundongo doador(inoculado 7/8 dias antes) em um camundongo receptor. O transplante foi realizadoutilizando-se agulhas (25 x 0,7mm) e seringas estéreis, sob condições de assepsia. Ascélulas foram utilizadas nos experimentos de citotoxicidade in vitro e para odesenvolvimento do modelo animal de tumor em camundongos Swiss fêmeas.Para realização dos testes in vitro, uma alíquota de 2mL de fluido ascítico foi retirada deanimais com tumor ascítico de Ehrlich (inoculados 7/8 dias antes) e imediatamentelevada a centrifugação por 7 minutos a 1000g. Após centrifugação, as células de CAE(as quais aparecem como uma fase esbranquiçada sobre as hemácias e no soro) foramremovidas do fluido, ressuspensas em 5mL de PBS estéril e novamente centrifugadaspor 7 minutos a 1000g. O sobrenadante foi descartado e o pellet de células foiressuspendido em 5mL de meio Dulbecco’s modified Eagle’s (DMEM) suplementadocom 10% de soro fetal bovino (SFB) e 1% de penicilina/estreptomicina. Para avaliaçãoda viabilidade celular foi realizado o teste de exclusão do Azul de Tripan (como descritono item 4.7.). Células viáveis (incolores) foram imediatamente utilizadas nosexperimentos.tumorais4.9. Estudo in vitro do efeito citotóxico da SPB e SPGP sobre célulasA citotoxicidade da SPB e da SPGP foi avaliada através do teste do MTT, seguindometodologia descrita por Plumb e colaboradores (1989). O ensaio do brometo de [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio] (MTT), foi primeiramente descrito porMosmann em 1983, e se baseia na capacidade celular de converter anéis do sal detetrazólio, de coloração amarela, em cristais de formazan (de coloração azul escura).Essa reação é realizada por enzimas desidrogenases mitocondriais de célulasmetabolicamente viáveis, e os cristais insolúveis formados se acumulam no interior dascélulas. O número de células viáveis é diretamente proporcional ao nível de formazanproduzido, e é avaliado pela leitura de absorbância a 570nm, após solubilização doscristais.70
Para realização dos experimentos células de diferentes linhagens foram semeadas emplacas de 96 poços (RT2 e T98: 500 células viáveis/poço; CAE: 2500 células/poço) emantidas em estufa de CO2 (5% CO2 - Cole Parmer) com atmosfera úmida à 37ºC por24 horas para completa adesão. Após esse período, as células foram incubadas por 48hcom diferentes concentrações da SPB e da SPGP. Após 48h de exposição aostratamentos, as células foram lavadas com PBS e incubadas por 4h, ao abrigo da luz, napresença de solução de MTT (0,5mg/mL de tampão glicina). Os cristais formados foramentão solubilizados com 100µL de DMSO, e a citotoxicidade celular foi medidaespectrofotometricamente em um leitor de microplaca UV-visível (Molecular Devices)a 570nm.A fração de células sobreviventes nos grupos tratados foi calculada como porcentagemdo grupo controle, sendo a absorbância no controle considerada 100% de sobrevivência.Os valores obtidos são resultado de dois experimentos independentes, realizados emquadruplicata.4.10. Análises morfológicas in vitroAnálises morfológicas das células foram realizadas rotineiramente durante a realizaçãodos testes de citotoxicidade, utilizando-se Microscópio Óptico Invertido Nikon. Asculturas foram fotografadas periodicamente para registros de possíveis alterações namorfologia celular, sendo as imagens captadas com Câmera Digital Nikon Coolpix4500 utilizando contraste de fase.DAPI4.11. Análise das alterações do DNA cromossomal através da coloração comO DAPI (4´,6- diamidina- 2´- fenindole dihidroclorido) é um corante fluorescente,capaz de se ligar especificamente às fitas duplas do DNA cromossomal (Kubota et al.,2000). Para análise das alterações do DNA cromossomal, células foram semeadas emplacas de 96 poços (RT2 e T98: 500 células viáveis/poço; Ehrlich: 2500 células/poço)mantidas por 24h em estufa de CO 2 para completa adesão, e foram posteriormente71
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