Identificação do efeito antitumoral de um polipeptídeo isolado da ...

A obtenção de um componente protéico purificado com atividade gelatinolítica, foirealizada através da adaptação do método de Carrijo et al (2005), utilizando quatroetapas cromatográficas. O peso molecular aparente da proteína foi avaliado por meio deeletroforese em gel de poliacrilamida-SDS, conforme descrito no item 4.5. A presençada atividade gelatinolítica foi monitorada por meio de zimografia (conforme descrito noitem 4.6.).4.4.1. Etapa 1 – Cromatografia por filtração em GelImediatamente após a extração, uma amostra da SPB foi aplicada em coluna de filtraçãomolecular Sephacryl S 200 HR (1,2 x 120cm), equilibrada e eluída com tampão fosfatode sódio 10mM pH 7,4 contendo 0,4M de NaCl. O fracionamento foi realizado a 4°C,com fluxo de 5,4ml/hora, as frações foram coletadas com volume de 1,8mL e tiveramsua absorbância lida a 280nm. Este comprimento de onda foi escolhido paramonitoramento do perfil de eluição do conteúdo protéico das amostras, pois representao pico máximo de absorção da radiação eletromagnética na região do ultravioleta,gerado pela deslocalização eletrônica presente nos anéis aromáticos que compõedeterminados aminoácidos (Dickson, 1999).Após quantificação do conteúdo protéico através da medida da absorbância a 280nm, aatividade gelatinolítica foi avaliada. As frações dotadas de atividade foram agrupadas edialisadas contra água destilada por 24h a 4ºC. A amostra resultante foi liofilizada emantida a -20°C até ser submetida à próxima etapa de fracionamento.4.4.2. Etapa 2 – Cromatografia por Troca IônicaO material com atividade gelatinolítica obtido por filtração em gel foi submetido àcromatografia de troca iônica em coluna de DEAE-Celulose (1,0 x 10cm), previamenteequilibrada com o tampão fosfato 0,1M pH 7,6. A amostra foi solubilizada e aplicadacom tampão fosfato 0,1M pH 7,6 e, após adsorção, eluída com gradiente não-linear(“step-wise”). Para eluição foram utilizadas soluções do tampão de equilíbrio contendodiferentes concentrações de NaCl (0,1; 0,2 e 0,4M). O fluxo foi de ~1,5mL/min e foramcoletadas frações de 1,5mL. Para avaliação do conteúdo protéico, as frações coletadasforam lidas à 280nm. As frações eluídas na mesma concentração de sal foram agrupadas65